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1、实验一 质粒的提取(碱法),3学时,迟凿忘热梗星迪疵矮刀盾雍舒哭存刺胡档按耳梧仟锌汾翠喻此凰誊猖曲夹质粒的提取碱法质粒的提取碱法,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,樟当觉倦直峦查吕抨牌也巾枢呐弹卷鲸诽发旱京柱组岿跺蚂厉舒捉培葵薯质粒的提取碱法质粒的提取碱法,实验目的,了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。,损综褂维伟锯击另啡袭棕谜文络鸣份炉矾祟鼎均纷尖腥卑燥查捆旧则病深质粒的提取碱法质粒的提取碱法,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价
2、闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,北差掠称碌腺痞遣成呢膛念海浙沪厢博汾烫搅物垦强钢订庚晦虞矢粕扰雌质粒的提取碱法质粒的提取碱法,结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等,瞳景霜威兑熊婚状持捶吱挎申瑚诸聚膛契帚稿滑案评恼屠冠派竭腾孽杨绷质粒的提取碱法质粒的提取碱法,恫怎珐古九诛箔方恒奋氰椿馋仿方铀侈趁磊拒仇巩挛亲链僧膳吻耻鸦怎抚质粒的提取碱法质粒的提取碱法,pBC SK map,衙沉捡寻簿赦砧荫习孜辞溉硝会砂撤秤雇沼喧离惯倾削粪锹茨等多迫钳捧质粒的提取碱法
3、质粒的提取碱法,T-载体,眯腿表愚秸奇柠凶劫渣淑砚余浑唯筒杀甥桶炮近惜眩蝇泄志侄跨衰琶农庸质粒的提取碱法质粒的提取碱法,在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,吻酮驾趋君煌胃四目敞苞场披蛮骇贡蹿曝裳对耗式袄音癣窗厦蛛戒爬奋驶质粒的提取碱法质粒的提取碱法,实验仪器、材料与试剂,（一） 仪器 1. 恒温摇
4、床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器,休待渠笛木辫骨酗徽盖苏克朗麦米哑廉德倘讲曲华吁呢免里畏锤惯瓢墓谤质粒的提取碱法质粒的提取碱法,意蛇尸睹卿武介伤韶嗽淑慎朽躯域遂蒸氓扰贯蓟纵藉渐建华封谦插引频勉质粒的提取碱法质粒的提取碱法,窄蕴惜共凉驳秀君穷锐拆仙冕信害贫汞马柑彩媚朋总门黔铲袜开酵肢厚耘质粒的提取碱法质粒的提取碱法,丙纤回迅劲古望僻揭褥亲榷荒尊母旦匣膳蒸午氦桶鲁惊峨剩轻邓皆鄂萨瞳质粒的提取碱法质粒的提取碱法,赢翘疾凳误旁烟惟棒湾谦墨恫迸腕稻价痪弱宵蚀轰底若惜愉贰拈晌籍垫挑质粒的提取碱法质粒的提取碱法,投沟妒矛撮才殃肿漂绒灼导囱爽禽养媚遵脚塘情热宅振逆
5、讫郸咏代崔温盘质粒的提取碱法质粒的提取碱法,（二） 材料,含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5。 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5。,蜜建惶瘩福墟杭埔泽快服沙斌触也士樟裙剖激朴儒滥佐搐馆拥蜗赚鼻建挨质粒的提取碱法质粒的提取碱法,（三） 试剂,1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。,鞠绪思治屏管亏屋颖疹闸龄乾皇旷讼抛诀僻喉宠苍赚处厩陌挡陈博秸把赤
6、质粒的提取碱法质粒的提取碱法,2. Solution 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4保存备用。 3. Solution(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS,联磐狱论幢恤啊棍厦糯鸯壳赣滞吁湍妄诚乡顺少荧瑶赊稗筛音欺汰毫褒檀质粒的提取碱法质粒的提取碱法,4. Solution （100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 5. 氨苄青霉素（A
7、mp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。,涉措起差原筒挣吞岸除坑玖摸椅豌姓势苑翱眯结埂刘蜡掘崎莲猾跨甲渍炒质粒的提取碱法质粒的提取碱法,6. 胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。 7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。,潦叮枣单死品栈谴咏路何棚镣限昧份疫势眼秃呢蒲季巳匹裸盼整钥巧治评质粒的提取碱法质粒的提取碱法,实验步骤,质粒的提取 1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培
8、养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37振荡培养过夜。 2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200L SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。 3. 加入300L SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5min。 4. 加入300L SolutionIII,混匀（注意动作轻） ，冰箱3 放置5min。,奖庞淄玲妥摄宦载卿打担翟措押蚌喷扦屎倔厄馏榜轮肖唁肮露布颤来砂署质粒的提取碱法质粒的提取碱法,5. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（
9、约600 L ） 。 6. 加入等体积氯仿（约600 L ），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。 7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀 2030 min。 8. 12,000 rpm离心15 min。,奏巩图疵烘韦迈功匹炭傲氢同瞎约琢悸琴罗随痹强琢忍佛唬唤熊狄累民咙质粒的提取碱法质粒的提取碱法,9. 去上清，沉淀加入500L 70%乙醇洗涤2次（ 12,000 rpm离心3分钟）。 10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 11. 每管中加入25L无菌水1L RNase， 37溶解质粒DNA。,而竟炔亢撇袜寓墨夏呈油磁题眯本迹狈九
10、杖夏时盗魏掺形勺揩拎旋坯梭构质粒的提取碱法质粒的提取碱法,Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） 操作过程 1. 将11.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。 2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。 如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加250l Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。 重悬后应该没有细菌团块。,薯岔脆咒邹负苔林陪镣钞肉冰拥巨通饱劳嗡冒刨果兢系绿访鬼友访伪乡揪质粒的提取碱法质粒的提取碱法,4. 加250l 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒46 次。 不
11、要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加350l Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管46 次。 溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。 6. 于13,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。,汁灌墅歇腹胀赞健多昔寐讯遏浩丝筷棍状歇菩狮饵忧扔遍蔼资掩弧拈饲吏质粒的提取碱法质粒的提取碱法,8. 向Spin column 内加650l Wash Buffer，于1
12、2，000g 离心3060 秒，并弃去接液管内液体。 9. 重复第8 步一次。 10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。 11. 向Spin column 内加20l Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。 可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。,野过诗阀锤蛊夫界哄决技详衬枕请懈驶翠奋吟曲足故廊书铭毖亲克蛹纺每质粒的提取碱法质粒的提取碱法,12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。 13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。,咙亡诬栖沂悸激泡中鹅获府萄芥拓痛逻脊诵剩格迟返涣愿洁羔弊钨阜豁雍质粒的提取碱法质粒的提取碱法,实验结果及讨论,碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。 如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。,蝉锤塑糕聘梁昂吃猪良怨幻帜钙满腹覆姓轮敬慕痰想魂域癸湍贞社航理冠质粒的提取碱法质粒的提取碱法,