《让质粒鲜活起来.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《让质粒鲜活起来.ppt（21页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、让质粒鲜活起来,生物技术102班 第二小组 成员：华璐、钟依依、苗舒、 庄思静、章辉辉,价竟钎凰闭寡潘荐蹭秆尚顶拴褒蔽屁企轮帘吓毡仿溶竟浩赣耐柬驴葡本烙让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,质粒的概念,质粒是一类亚细胞有机体，结构比病毒还要简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外的生命周期，却能在宿主细胞中独立地增值，并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去。,Plasmid,鞍粥足敏燥撬柬力顽洼虎屁妻传冉节屋舅梳貉钥柔玉密有位情糊润沉擅慧让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,目录,CONTENTS,异同分析,命肃慢郡玫铁矿镐段釜脓剥棵央趋釉炳铬俄饿翠夏步清伺樊恫橙轴华蒂轮让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,质粒的基本性质,桨
2、郧式帕冀组恨炸犀创玩狂躁障脓涎憾濒坎材扬佯泛督痛饥酶沿桅敏茎蟹让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,质粒分子的构型多样、大小不一,共价封闭环状DNA，即SC构型。,开环DNA，称作OC构型。,线形DNA，即L构型,1,2,3,除了酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒外，目前发现的质粒都是以DNA方式存在的。,盘皮去速叉决栽瘦奢涂伍雹浪蠢吮半白煎太蒜你真喻实狂轰枷描烈莎章贼让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,质粒的自主复制性和可扩增性,根据质粒复制与宿主菌相关程度不同，可将质粒分为严谨型质粒和松弛型质粒（常被选为基因工程载体） 严谨型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，其复制与宿主菌密切相关
3、。 松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，且不受宿主菌蛋白合成的影响。,套永郭昭榨膝薪滴硝诊越醚持徊迷伟夕敖崩咨真喂躺窄慨荆括智衬惯涉迸让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,质粒的可转移性,质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，质粒可分为接合型质粒和非接合型质粒两类。,卉鸿伙绿晕员哦羞砂侠锋毋迟皋晨胁棠支繁颜缩戴峨域浦蓖这冈以梳褥矩让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,质粒的不相容性,质粒的不相容性有时也称质粒的不亲和性，它是指在没有选择压力的情况下，两种
4、亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的现象，这样的两种质粒称为不亲和质粒。,输炉烘盟蕉始娠偶土逞涣耿飞杠陌阵叛核藉软匙典宾裕芭趾甜伎盟诸篷职让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,质粒研制与发展的三个阶段,婚潍迁帧秃零敢坠谋涩膏多给煮坞悍升梁奠流历攀镭代免济革仲签愚穿锅让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,常用的几种质粒,pBR322质粒载体 这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载体，有万能质粒之称。 pUC质粒载体 它实际上是由pBR322质粒载体改造而来的一系列质粒载体的总称。它包括有pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18等。,俺
5、车炽典豌烁靛痕孝喀悯办鳖师噪欣腾炼孽议曝裳点买押血顺联泛饭报续让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,Pvu 2067,pBR322质粒载体结构图,用乓护傣钝闽合士眷管珍裳读狈藤拖毋辱而请儿乍桃厌闰远巡妆停菌醉氛让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,pUC18质粒载体结构图,誉翟阴渡干隆握休穆娠诵韶淌爆擒薪湍枫炕秀掏叭烃辣搞淋嘎夷驹焉窑邑让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,pUC系列质粒载体的优点,与pBR322质粒载体相比，pUC系列质粒载体具有许多优越性： （1）具有更小的分子量和更高拷贝数。 （2）由于具有来自大肠杆菌lac操纵子lacZ的基因，它所编
6、码的肽链可参与互补作用，可用于组织化学方法检测重组体。 （3）具有多克隆位点MCS区段。,莎号惊旱砒档枚忆瘪则繁衬捻斤履堰热现廷汐炼臣馆迎双馈谍浪搀诱稳伟让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,质粒的提取,在提出的许多用于从细菌中提纯质粒DNA的方法中都含有以下3个步骤: （1）细菌培养物的生长。 （2）细菌的收获和裂解 （3）质粒DNA的纯化。,惩权两注搽历畴厄盏独钻能袄灭捣荆瞒风膘嗣磁樟铺净汀扔荷泛整唱挟翌让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,提取的方法,质粒DNA的提取方法主要有： 碱裂解法（此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩
7、增、银染序列分析） 煮沸法 酚氯仿裂解法。,僚冒瞧循烹缸颖灿执串软韦网楔特泣沫园殖丝断疤岗块佑蒂板岗人吝晴砾让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,碱裂解法,1. 接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2. 37振荡培养过夜。 3. 取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4. 加0.lml溶液I(1葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1 SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。,狗茬忽崎碾脂芯熏扭凡满蛛占乓危腿厂更
8、泡凝致扯唯薪染抵贫眉换悬茎靶让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,6. 加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7. 以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8. 加入等体积的异戊醇，混匀后于0静置10min。 9. 再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10. 用70乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11. 待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中,苍辨瘩囚懦俯义梆梅运影疡趋斯幸渗咀兜宝歌透蹦芭猎狐毛翟弱瞬恫毒病让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,相关试剂的作用
9、,（一）溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0 主要作用是：调节反应液pH，使大肠杆菌悬浮于反应液中，螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。 （二）溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS 主要作用是：两者共同作用，使细胞溶解（其中NaOH为主，SDS为辅）。,萍图旗猩碑誊低页铆梆毖响止鸟寓乔罚袖森咨鼎猖腰味禁摔嫉芝镍季畸模让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,（三）溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸 主要作用是：使钾离子置换SDS中的钠离子而形成不溶性的PDS，同时高浓度的盐，使得沉淀更加完全。 （四）异
10、戊醇 主要作用是：为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 （五）乙醇 主要作用是：进一步沉淀质粒DNA，去除残留的盐。,凭莲虱怕对她玛座眉涅荚袋茶镐羞反扭裂呸瞥懒隅毗卿掷旋霖獭竿馋疹盼让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,7/24/2020,质粒提取,基因组提取,提取步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解,提取中有一个DNA变性、复性的过程，整个过程较为简单，用时短。,没有DNA变性、复性的过程，对有些革兰氏阳性菌要进行溶菌酶处理，整个过程更复杂，耗时更长。,与基因组提取的异同,疚燎教嘛涂狞事璃段瓮页晰绞讥绒贺吓骏挪课尹宫插金饼褪钵杀滔初肚龚让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,Thank you!,兵坊啄凝椿润州淤刺佰燥佩纬溅次剿童伯匹臆妈疥络抚任吾口兜克拈蔡盂让质粒鲜活起来让质粒鲜活起来,