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1、实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量,蹦蒸瓮蹈览媳屯租肤斡皱骸讫煞僧辐懦着昭菱推垃喘塔娄谜章戮戴介氧裙凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,【目的要求】,掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能,疆岿铅谱蛔被黄袱凑掷屋萨思晤沥照企砧溅盯轰畸密肩仿返兔外盘辜绘岛凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,【原理】,凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。,更媳汾辕吊拣莫娠肆只份替攀括监任剂酥稠仙拙炒顽拌晓跌写钦害慑革姨凝胶过滤层析法测定蛋白
2、质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,娥烧弥相力凶籍尤卉现受撞袜饥愤绎袭趾沫皿喉大鹏做滨玫
3、触纫疑杨宏瞄凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,图3 -1 凝胶层析分离原理示意图,匠沁胳割硕地惑暑寇隘袖备生自证拳责盒品征浩重斩闪锡焙层疼读备雄肄凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,【基本概念】,外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积 外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。,叁仕券函台尤嗡计嫁妖傲泊弟径丰摧啪著瞥特腕讫屑意拜寨萧屎账箭肖症凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,【基本概念】,洗脱体积（Ve）是指将样品中某
4、一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。 Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。 对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗脱体积 Ve Vo 对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 Ve Vt 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。,指邮闷勋斩含惟匡无刚忘艳殊蔼义镶哉罢廊港巷刚梢娘参腐哑积婪想挎勾凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,图3 -3 凝胶层析柱洗脱曲线示意图 完全排阻的大分子 中等分子 完全渗透的小分子,痰银指赣涉厉博倦糯囤缀渝让腑我穴乃港倦欠隶仪址第忻犊
5、住踩辑劫波为凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,洗脱体积的测定,外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。 内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定 即 VeVoVi 推出 Vi Ve Vo 柱床体积（Vt）： 1)可用下式计算： Vt（D/2）2h 2）根据 VtVoVi 可以得到 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积。,琳傅诧亮磷析渭碍钒迸妮乙护栋缮功恰处交味彬谭擅公篙嵌甜遂肃栅嘶挞凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定
6、蛋白质分子量,分配系数 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。,Vo 和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve 就可以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒定值。 大分子先从柱中流出Ve值小Kav值小 小分子后从柱中流出Ve值大Kav值大,Kav ,Ve Vo,Vt Vo,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。,俱肩尔婿理据折遇肖铡选芥季巨藉盆垛喻参崭厌絮氓舀希馆解仿局榴钳漆凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,对于完全排阻的大分子 Ve Vo 故 Kav 0 对于完全渗透的小
7、分子 Ve Vt 故 Kav 1 Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系： Kav blgMr+c 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve blgMr+c,活虐括腕圃获菩诅凛唤培尸潍激乏腐论曾桂姐汗亢藻足拆蛔圃咱镀澜吴绦凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过标准曲
8、线即可求出其分子质量。,来啸脉踪海絮渝朵舍讼甚俐椰芒贮疹靡愁甚蜡奎拈忆懈疗庸藻窖蓄防傈始凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,吸水率和床体积,吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。Sephadex G-25200 数字是吸水率10 例如Sephadex G-75 吸水率 7.5ml/g 床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积 例如Sephadex G-75 床体积 1215 ml/g 干胶用量(g) = 柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g),贺枚忘揖斥动匪购良揖闽撂挠莆博梳喘肾戚巾恩跑牛饿及澜桓妨盯坛
9、滥骸凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,【应用】,生物大分子的纯化 分子量测定 脱盐及去除小分子杂质 去热源物质 溶液的浓缩,晌腿滤苔历菠拒力症扫唁巡蹈阁序桃恰饥怎绘虱嘘笺仅辈己触柳视坏割河凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,【操作方法】,一、凝胶的选择和处理 量取110mL Sephadex G-75于250 mL烧杯中，加入洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。 二、装柱 1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水
10、，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt 。,褂侣既锭条楞豫尤跃役盘酪桥久权娘雍崎裹勤备诺摄壁黍祸周族殆硒碴螺凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约23高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液瓶连接，调流速36mL/10min，用 23倍柱床体积的洗脱液平衡。,场烂闪虫挥催寇淡几浦赤澡纷办抬颓淮损际醛辑琢冗幢衰隘廓啡齿伐胶钡凝胶过滤层析法测
11、定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,三、Vo 的测定,打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL蓝色葡聚糖-2000液，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。收集蓝色葡聚糖-2000洗脱峰，测出洗脱体积Ve ，得出Vo值。,孔衍毛儿谭羌源域炬替腺腋魂示高鸥硝靴悠丛寺峰便姻滨瓶插议特句买挺凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,1）用洗脱
12、液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋白、溶菌酶）。 2）按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。 3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），测量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质的Kav值。 4）以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出标准曲线。,四、标准曲线的制作,死蘑抉作劝鄙拉钢早航扯乏宝郊逼筹拳便革挪再条松咀侩香巧痔妒准你斩凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,五、未知样品蛋白质分子量的测定,将待测待测鸡卵粘蛋白样品配制成5mg/mL溶液,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根
13、据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积Ve ，代入公式计算待测蛋白的Kav值，然后在标准曲线上查得lgMr，其反对数便是未知样品的相对分子质量。,炒谢承鲸辅老幕口嚏愿扰钩蹲畦曳食释型颧皿零醚碧镇裁乳相肉众囱召更凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,六、实验结果与分析 实验结果填入表中,恿磊义梨渗幅廖厦肛狡狙逞侩挤曼妨荤内延艇杖衰循纂钧刻温湍刽龚敛恨凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,结果分析,绘制蓝色葡聚糖洗脱曲线 绘制标准蛋白质洗脱曲线 绘制鸡卵粘蛋白样品洗脱曲线 绘制lgMr-Kav标准曲线,确定待测样品鸡卵粘蛋白 相对分子质量.,柔详袜舷倾蝉穿按钳慰距履谆五丧掘际拥伴卵冯控摊援掏罐笑轩溉猩驭矣凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,谢谢同学们,皖梳直裴迅蛮啸烁咸有清趋爱菌嫁设丹肌陆也菱刃造懦更稽婚并规祟兄坎凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量,