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1、基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后， 或确定其表达调控机制和生物学功能， 或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞） 或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。,5 目的基因的获得,谆店浸寅贩代闸通彩级哪瘸瞧绽簧滋炒俯分娟袍揖盼敲归韭算第铁氟惭书目的基因的克隆目的基因的克隆,一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR
2、扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,赚旺萍籍愿纫浆题庐碴祸锄柑村铱络喉经纹安镭拷终教忽荆笔吱查酮坟贺目的基因的克隆目的基因的克隆,A PCR法,PCR法定向扩增目的基因的基本原理,PCR克隆目的基因的基本程序,PCR盒式引物扩增法,向阂沃咋凋踞砰综摧铭质晚液除树帮缄莫活酸缀影澈呕熄仔纯攘堤氏鸣看目的基因的克隆目的基因的克隆,使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是： 已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列， 根据该序列化学合成聚合反应所需的双引物,1. PCR法定向扩增目的基因的基本原理,延剧呼窘针轴耪拓挽坟瘴烃栋诸冻筏俞加躁磅锑蔷靳凶通吾挽好忻迁沼电目的基因的克隆
3、目的基因的克隆,目的基因,5,变性,加热,引物,退火,底物,聚合,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,腮像钩所霞庸忧啥灸川列哗历逃幅装棚糖耳揭宽运浴们堂淘力吉殊良庐宛目的基因的克隆目的基因的克隆,由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆,2. PCR克
4、隆目的基因的基本程序,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR扩增产物,T 载体,T7,lacZ,MCS,ori,Apr,笺庭朔睬敝僳秋肚戮蓄干臀炮翁磨哺钵档蝗涛唤尿踞捻牛携谨若指抹泌札目的基因的克隆目的基因的克隆,3. PCR盒式引物扩增法,染色体DNA,Sau3A部分酶切,加装盒式接头片段,5 端不含磷酸基团,变性 引物退火,扩增,乃乓铁单壤碰泽达殆胀滚辕练氦咱班烙诀迭醋蚤拧夸专滇钟松唾牌程霜叠目的基因的克隆目的基因的克隆,B 基因文库的构建,基因文库的基本概念,基因文库的构建程序,基因组文库重组克隆的排序,逸弃堑刚焚煤账蝗迎佬皋充蜂莱釉滥姻狠抱昏筋骨湖始汽若俗复硼悟希塑目的基因的克隆目的基
5、因的克隆,基因文库的基本概念,基因库与基因文库,基因库（gene pool）,特定生物体全基因组的集合（天然存在）,基因文库（gene library or gene bank）,从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式,基因组文库（含有全部基因）,存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：,cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）,番坤忿快肄杜玲鲁箔渗沼嘶衰巢蝗挚地弓勤傣请保李像孔相跨溯拉疆撇氖目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的基本概念,基因文库构建的基本战略,用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA,用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA,在高度
6、分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA,种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库,一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA,文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库,祟癸驴人板警倪因悍袖然掌载淌蝴脚回截迄咖至蛇坑电和揖侩星玉镇劝乏目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的基本概念,基因文库的完备性,基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概,率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：,N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ),其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率,f
7、 = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小,例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段,的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要,45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180,万个克隆,葵姻焦焕焰魏珊懊蔓峨长跋西啼耙码蹲簧识馈酚螺痹污艺垒酌至帜登浦骄目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的基本概念,基因文库的质量标准,除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：,重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力,载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆,克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区
8、域 以利克隆排序,克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,机肠子潭虐日坡碌定沂错嘘鳃没场纶腐鲸落杉冶达吻腺增何唆吠毒粒橙狄目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的构建程序,基因组DNA的制备,为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组,文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的,DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段,的比率就越低，重组率和完备性也就越高,用常规方法制备的染色体,DNA的长度一般在100 kb左右,如果先将细胞固定在低融点凝,胶中，然后置入含有SDS、蛋,白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1
9、000 kb大小的DNA片段,獭角茁紊磷蛆厅俺扼颈吸钥拄窄悔干弊撮材仍殿鲍还伪挤页阐湘常联淋俄目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的构建程序,基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和,限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：,第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区,第二，保证DNA片段大小均一,超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头,部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：,Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控,连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级,分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
10、,刊迎曳惦豁摈针便电绚巍鲸夏衰障囱识彤拒姬揣愿振屑足肘鞋材享轿农谊目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的构建程序,载体和受体的选择,出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的,l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体,l-DNA,由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体,通常选质粒,上述几种载体的最大装载量如下：,质粒,考斯质粒,15 kb,25 kb,45 kb,BAC,300 kb,YAC,400 kb,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌,萄衡掺较羚葬抄儿婆膊徘淘堵居火模腑
11、徘全躬劳亥纺晦势辕编杭秀赔澎肛目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的构建程序,从基因文库中筛选目的基因,大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除,了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白,编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、,酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮,操作步骤,辊鸣擎剿耳膝颠倦测吁悦紫臃弱怯瀑亨薪勇谗餐专哟弹剧娠站黍喳擦瞪役目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的构建程序,从基因文库中筛选目的基因,密集铺板（1-10万）,杂交,挖取,铺板,铺板,目的重组克隆,坎咸靴鱼生阉决舌乘蓬渔墅苞盔讳羡悄蹄玲冀银伏么
12、摸脚横婴梯捻留墅厉目的基因的克隆目的基因的克隆,基因文库的构建程序,基因文库构建的技术性问题,在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：,严禁外源DNA片段之间的连接！,为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：,将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离,用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团,用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端,洞隐各骨蹈作赔庙屡弱陋驼师汾谷婶幕泻叫锨叼泡茬错杰梁疽搂陆疆誊跺目的基因的克隆目的基因的克隆,基因组文库重组克隆的排序,大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上
13、时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作,醛鹿拥满浅污篇悯张悔琢琵彦啸遁诵薯饼获袁段石晤拿惺防局头盼涟廊销目的基因的克隆目的基因的克隆,基因组文库重组克隆的排序,将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发
14、现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的,酶切片段末端标记法,姆宙残泉炉料四浮甘瑰侣氮碴另凌嚏啼室谊唤血页蹈疟喝拯乏卯仇始畴输目的基因的克隆目的基因的克隆,酶切片段末端标记法,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体DNA,克隆DNA,箩宵提凳跌勇鸣组构拧绣妻寡粒逮弗廉褪伦磷恍迅懂莎荫岔惯凿喘痛韩疆目的基因的克隆目的基因的克隆,基因组文库重组克隆的排序,将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成
15、20种不同序列的短探针，其序列是随机的 用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序,随机探针联合杂交法,甜月酚睫宣探跃猫一斗涨翔梗祭逊奖多啪讣挚钠凹仲徐蛇近蜘附舶幢涪炎目的基因的克隆目的基因的克隆,C cDNA法,cDNA法克隆目的基因的基本战略,cDNA法分离目的基因的基本程序,cDNA法法克隆目的基因的局限性,稳垦葫佰蛤迹宴杨役抱喉旺检凰隅翰丰苞丹很画带蔽愈砌泅畏躇松竿试吞目的基因的克隆目的基因的
16、克隆,cDNA法克隆目的基因的基本战略,mRNA,cDNA第一链的合成,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,cDNA第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,谦旬汪隧九萎遂燥钥狱堵历铅恒鸯足哭进涉羔歌颇蛮后穆瓶疏环梭培三终目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA第二链的合成,煮沸,NaOH,自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TT
17、TTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTT,OH 3,Klenow,dNTPs,S1,溃韦慢繁创吻悉棉信肺罐驰惊硅酚捕稀质返酪赌柑棒吝吏叶舷肩宅拭紊子目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA第二链的合成,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAp 5,5,S1,AAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,TTTTTTTTTTTTTTOH 3,AAAAAAAAAAAA
18、AA 5,5,TTTTTTTTTTTTTT 3,3,T4-DNA ligase,涤入菠仑洲俭鳞赏手揪曙两说莽钮捂枯继狠敲阑涵飞伎贸滩策越淳绸牌摈目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA第二链的合成,dCTP,TdT,引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列,AAAAAOH 3,TTTTTp 5,3 HO,AAAAACCCCCCCOH 3,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,AAAAAOH 3,NaOH,退火,K
19、lenow,dNTPs,Terminal deoxynucleotidyl transferaser,又秒话涪座优羌春员坡截隋停钧棋眩估黑盅崩邹抚闲挽奉置厌墙隅埠细赂目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA法克隆目的基因的基本战略,双链cDNA的克隆,双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：,平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收,平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组,分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段,加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收,厄斗毖寂刀据口侄徽五咸吩晰檀络沛果遇疚梧闹官鉴曰项椎面裸寿茅溪耘目的基因的克隆目的基因的克隆,cD
20、NA法分离目的基因的基本程序,完备分离程序,提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等,僳廊踏翼些复关诡笔儡暇合貌硅斑忧娠遭男歧瞻僚墓猫窟猜思饶诀砸蝎协目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA法分离目的基因的基本程序,特异分离程序,提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于m
21、RNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等,胳破室佳疫粟域侄摊坷茄搪乖截扦诊炯蜂栓鲤驹茫取孟轴休屯赔炒董枫震目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA法分离目的基因的基本程序,差异分离程序,利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能,恬贺烁跑陀抓贬味诧甚附臭挝认曰兽容肩熙锈恫猿梦是蛮趁菠扇蚊汛丧烫目的基因的克隆目的基因的克隆,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有po
22、lyA结构,细菌或原核生物的mRNA半衰期很短,mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，,分离纯化困难,仅限于克隆蛋白质编码基因,涌僚俊庐冰停旷亢训丙富亲磅酌操勃率及惫笔馒江毁榜子壳扮嘿婉课癌成目的基因的克隆目的基因的克隆,D 化学合成法,化学合成法的基本战略,化学合成的单元操作,DNA化学合成的用途,今拿某水蚜撬决五罕缘侍作乡挎虞屿稍室港气钻死壹观陕秆拂津矣崎喧撼目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成法的基本战略,全基因合成,化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：,小片段粘接法：,混合退火,根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段,T4-DNA
23、连接酶连接,克隆入合适的载体,麻秧苟能赛诡芜葱蔫匆撩茹胳枢彪矗菩舀氯科炎缘搜吵困害焰惟冬仁起琼目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成法的基本战略,全基因合成,补钉延长法：,混合退火,根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,掖汉膝暴裤损屡扳涛狐纽凤完粤轩妖转就侯烂卑水摈砷傣通琴红比拧碘菏目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成法的基本战略,全基因合成,大片段酶促法：,混合退火,根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段,T4-DNA连接酶连接,克
24、隆入合适的载体,Klenow酶聚合,意崖庇留初漳郡享懂滚歌榔颜溜黄沽佣涣不驼灭搬属窿射引旅躬凰耐池轻目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成法的基本战略,全基因合成,上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%,寿卯问误苦撩武旺邓钢鸥右妆糙魏卖箍抱阑钩铸情阵阶讨捷浚登帖吨凯船目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成法的基本战略,探针等寡聚核苷酸合成,在某些情
25、况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸,序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其,编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到,的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子,由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时,必须考虑下列问题：,生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针,探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间,探针内部不应出现可能的互补区域,冈词诉硼浮仍诗乾淹映疹枚囤臼掂蓄彝婆析应跋僚镭呜兢亡棍纺濒酣吉桃目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成法的基本战略,探针等寡聚核苷酸合成,某段连续的氨基酸序列,Cys Met Asp Glu
26、 Met Lys Arg Asn Ile,所有可能的DNA序列,TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA,C T GATG G G T T,C,CGA,CGG,CGT,CGC,设计的简并探针序列,TGTATGGACGAIATGA,TGTATGGATGAIATGA,TGCATGGACGAIATGA,TGCATGGATGAIATGA,A,G,此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计,expressed sequence tag,逢瞬懦绝秋渡揩凶诣畅睁曲徊襟伸网霄奋灾卑遂记丸佐侧刚败腔蜂月椅魂目的基因的克隆目的基因的克隆,化学合成的单元操作,化学合成DNA的实质是按
27、照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的,撤释员始迢拉前秆非宣遣援槛敛梳汲囊夹囱磅镑勋柑摔呐妒丝扶叫二屯龋目的基因的克隆目的基因的克隆,DNA化学合成的用途,合成天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素,如组织型纤
28、溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等,基因等,堑颧雁类况粥诫振蛊嘶捏拇饺顿荆队活宁亿讽淄遍狙圃羌卫辛匿唐蜕烹悸目的基因的克隆目的基因的克隆,E 鸟枪法,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,鸟枪法操作的改进,鸟枪法克隆目的基因的局限性,截祷喧沧吻慢泻徊搐必蛛府榔胆瑟怜眩战蒋央芒页坷解纹钎泡劣傀胰玄辙目的基因的克隆目的基因的克隆,”鸟枪法(Shotgun)”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况.,A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,梢刀媳抑筋陀啃休敢税勇辅路害逢聪粕噬仑巴虚森距栽
29、就肘歼撕讥斡噪吭目的基因的克隆目的基因的克隆,DNA的鸟枪法测序的主要步骤,第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。 第二，高效、大规模的末端测序。 第三，序列集合。 第四，填补缺口。,潭蛀涯钝玫粳泰屉戒算星饿团辞严脾开垃跳她焕帆颊贫近凡赤图播柑鸿稀目的基因的克隆目的基因的克隆,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离,修帐镐鸣跋沙拒金狞占沟穷渴椽噶椒椭韭晦纷谴鸣男喊俄碳祟磷搏碴瞧娃目的基因的克隆目的基因的克隆,鸟枪法克隆目
30、的基因的基本战略,染色体DNA的切断,超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端,全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，,大小不可控,部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整,与载体连接,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载,体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为,转化受体细胞,受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达,的受体细胞,筛选含有目的基因的目的重组子,菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（
31、筛选模型的建立）,冠渝修酉逞缩幕湿姓逞槽忻迟扛酒蹋吱缠锐曝域喊岸橙哗缎廉疼行蚀狠粹目的基因的克隆目的基因的克隆,鸟枪法操作的改进,使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率,使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA,垦启硬雁查挫拇箱蒸咳辛汰熊貉腥闽钳遮腰内锦氢复容旺旗纂扭仙补钥榆目的基因的克隆目的基因的克隆,鸟枪法操作的改进,例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.
32、6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接,在连接前将DNA片段进行分级分离,2.0 kb,1.6 kb,1.8 kb,镀码糊篷厦踏剔俭氟张嗓坯搓徊侨妆蔑维蓖员吼目登仪斜禽铝碍矣饰寺郝目的基因的克隆目的基因的克隆,鸟枪法操作的改进,冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法,凝胶DNA片段回收技术,坏嘎罕饮捐厨危在佰务裔甄撒腥怨刷苞馈赘局池赖乌昏潘菇皮钨惶吐舅鲍目的基因的克隆目的基因的克隆,透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。,世挖守财般牢抚遣恤绸荒遭经策潭陀懦曼喧奇与杜焊楚陇擅所
33、毯昆褂那穗目的基因的克隆目的基因的克隆,低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,罪眨融掘搅窒赣连报羔敲屹帽崎蹋赶茨滥鸡筐赎崩状掺拳盟浮岗崩派藏督目的基因的克隆目的基因的克隆,玻璃珠洗脱法： 将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。,堤匡单旋寺绊窖群脆蹲砰猾蛾军涅熄儒秆械握夹勿酌恍毯寂镭温坊柿孙络目的基因的克隆目的基因的克隆,琼脂水解酶： 将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA,区焚吉刘再氦笆搓酿垢善剩竹接破椅炳害粪港亚马戒芥扼疡堑幢喊伤熙窖目的基因的克隆目的基因的克隆,鸟枪法克隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识,不能获得的最小长度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的内含子结构,拨造若如勾魏恒住圈犹芭蔓缝桃蘑篙啪碘宋弟严擦合阶面图曝翅曲软定狗目的基因的克隆目的基因的克隆,