第二章基因工程制药新版2.ppt

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1、第三节 基因工程制药生产的基本过程,一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例,奴隋蛛揉并脖锭彭疾凭酥束伤盲姜殆邪景存精媳穿刽凑阂尾逾泣羚囱蛔禁第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,血红蛋白基因,血红蛋白基因排列顺序,血红蛋白的结构,血红蛋白的运送氧气功能,血红蛋白的基因

2、工程流程,荧健四俗兴叛伦随靳响进箔绕堂神写旬翻弄音巡臼钉鸟裁堵杏赛驳考士整第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,一、工具酶的分离纯化,（一）基因工程制药所用到的工具酶 （二）关于限制酶 （三）关于连接酶,煽私吭犯初职期种域蓟怂兰诺部套剐骨酗酱卵恩货铺浪侯狸稗徊云伟皿判第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（一）基因工程制药所用到的工具酶,限制性内切酶 甲基化酶 Klenow聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 核酸酶-S1 核酸酶-Bal31 绿豆核酸酶 核糖核酸酶 人外切核酸酶 DNA酶-1 外切RNA酶-III 外切RNA酶-VI DNA聚合酶

3、1 T4-DNA连接酶 末端脱氧核苷酸转移酶 T4-RNA连接酶 逆转录酶 大肠杆菌-DNA连接酶,侍援协灌离磋缎艇雄掺端秘帝赠良被筷躬呕涩清慷叛叭抒抉休降捉俺富公第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（二）关于限制酶,1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素,晤九痕囊柞凰补臂刃烘毡面拢炊菏跃煤娩第顶佛荫倔朵慌倾靶分杰辗慕乖第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,1、宿主限制现象,病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受到宿主B的限制,这种现象是宿主

4、控制性限制 （restriction）与修饰(modification) ,简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。,秉蛛峡摸蕉譬价恐移蒸掖箭出狙琐朋蔷心悦怔载娟诈哄姑惊韭祟数蓑蛀忌第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶,肃谩孝市漫赘乙薄奢痪攀亩叁贴帅柞瑚春歉斩舔陕可织蔗缚刷臃豆快间涯第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶,当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DN

5、A中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化 的序列。,埃傍黎榔胎青习也罢座疫焊瘪蠢椰轧惫搅沥筒活溶赖慢莱翔惋帕午哉骚咆第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解,ECOB核酸酶,甲基化酶,CH3,CH3,CH3,CH3,噬菌体来源序列,宿主来源序列,第梢行锡徐蹋草秧垃锗桨捍威轻当糯饥渺趋鄂岭狰葱滑

6、冤狄雕狐缴巷渊逸第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。,盒亭丹刮证乖估扯送悉雹乘我炉道桌占授瞎最疫篇茹汀秸凳柬雀粱痕僻聚第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,2、限制酶的定义,凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型： （1）型限制酶-由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。 （2）型限制酶-是位点特异性酶，是基因工程理想的工具酶。 （3）型限制酶-对D

7、NA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。,斌腮送律闽睹慢薛翁兄酚铂嗜废桌混践叉稠今淬制筛鲜链勋龟列邢汗机廉第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,3、限制酶的特征,具有专一性的识别位点。 能够形成固定的核苷酸单链末端。 比较适合于进行DNA结构的分析和进行基因重组。,让惭诈蛀蝶孪寝氯涉碴牟埔脑再脓漂喉匣泛穆刽缀鉴园梆稍赞扇杏澳仿捆第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,4、限制酶的作用,（1）进行DNA重组。 （2）构建新载体。 （3）构建基因文库。 （4）进行DNA序列分析。 （5）制备DNA放射性探针。,烤归也孤糕袍负缸社氢立冠访罗寒遏瞒誉坍伙然酱储赣既紊箱让槽

8、切套敞第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,5、基因工程所用到的限制酶,通常是型限制酶，具体有以下几种。 EcoR-I Hind-III BamH-I Pst-I Sst-I Sal-I Ava-I Bcl-I Hind-II Hpa-I Bgl-II Cla-I Hae-III Hha-I Hinf-I Hpa-II Mbo-I Sma-I Xba-I Xho-I,泡都康椅骆嘲摔冒跌金挎存灰冤脐搐犯送吟丢坪驻商耍等娟狗穗湃醉魂赃第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,6、影响限制酶作用的因素,（1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的结构 （4）反应的

9、温度-最适温度为37度 （5）反应的缓冲体系-反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。,去质尽嫉戏猾围达氧汁懒销启帐战需揪镭梅尸串啊兆蓖及捌殃夯耿油瞅煌第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（三）关于连接酶,1、定义-凡是能够催化DNA片段5-末端的磷酰基与3-末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。 2、作用-主要用于 （1）正常DNA的合成。 （2）损伤DNA的修复。 3、种类 （1）DNA-连接酶-广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E.coli。 （2）T4-DNA连接酶-来自于经过T4-

10、噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶-催化单链DNA或RNA的5磷酸与另一单链DNA或RNA的3羟基之间形成共价连接。,烈问尚节癸昂届包姨佃黄罩伯轿匠惫乙魄凶秧哑服吸帐镑熔陀筏浅啃恶氦第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,二、基因工程载体的分离纯化,（一）定义 （二）基因工程载体的必备条件 （三）基因工程载体的种类,翔漓官祷煽挣根熄孵萌巧木疽雄肪庶诞涪骗盖卫着然修澜几筐谅公裸涎尘第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（一）定义,能够将目的基因携带进宿主细胞、并可使得目的基因能够在宿主体内进行自主性复制的遗传因子，称为基因工程载体。,墅唯完纽帅矢莲

11、抬贪辊捌腔损鲜讼晒哼娃逆折胃凭烦袁滥鬃槐己疚矿皑砍第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（二）基因工程载体的必备条件,（1）具有有效运载能力。 （2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。 （3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。 （4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。 （5）能够携带大小不同的外源性目的基因。 （6）鉴定方便、装卸技术简单。 （7）容易控制、安全可靠。,疗祖茎泣官电押诚辙苯摹支就唬茎柔颐译翻蚊校酷舱俩眶樟抱耸流吏卧瘸第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。 （

12、9）应具有很强的启动子。 （10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。 （11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。 （12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。,浊油兰茧余猛珊办辈商春伸嗜竞舔呛坎疼塌拴钱履堑邪咱炎辕充熄旋眨常第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（三）基因工程载体的种类,1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体-科斯质粒

13、6、酵母人工染色体 7、其他载体,捕呈破穿挠愈泄杆瘸惊埃痉楚沿碘墩彩悸得切苗材涵砸衣惧庶抓绎街且侦第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,1、细菌质粒,（1）质粒的定义 （2）质粒的特性 （3）质粒的分类 （4）质粒载体的具备条件 （5）常用的细菌质粒,靠幽竹几闰群铸蛀臣碗缴冤凉媒埃拯泄柞河啤爆店垮臭遗没携铭离浙劲钢第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（1）质粒的定义,存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，常带有细菌的抗药基因。也存在于某些真核细胞（酵母的2环状质粒）,质粒载体(plasmid),哲箩注陶弯痛滑蹄顿凛戚掇膝盘球

14、嗓诱焰呵责索譬阑式车砰亲凹蚂曾酶竹第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（2）质粒的特性,独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。 可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿主额外的遗传特性： A、编码产生抗生素酶的抗性基因， B、编码产生糖酵解酶系的基因， C、编码产生抗重金属酶的抗性基因。,炽兼稽羚俗周敞剐慷磕简戮旁惶狞旧肘般嘱矮想场扰放破藕易糯糊峰它广第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,质粒的复制类型,严谨型（strigent plasmid)： 复制与宿主染色体同步受宿主染色体

15、复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约份拷贝。,松弛型（relaxed plasmid): 复制不受宿主染色体复制的 限制可独立复制，在宿主细胞中拷 贝数高，宿主细胞中质粒有10-200拷贝。基因工程常用载体。,赣势灿盼腹且纤水爵营俩颇鹅慢探漓颇烯碗迹姚糙注领互眷抄涵缀购吃熙第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,质粒DNA的构型,三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)； 若质粒

16、DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。,央制授勒乞古谤慨据诉遮腿摧词痞湛话纬堡滇身勾芋矗营允要侄苍唬命靶第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,共价闭合环形DNA （SC型）,开环DNA （oc型）,线性DNA （L型）,环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型,征绸凡纯摹爆疽亩浓铺缎鲁酚迪为忿绣积瞎砚子择柴矣宝娜烙救脉瘦壁迫第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（3）质粒的分类,F质粒-可使宿主A的部分基因随着F质粒一起转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。 R质粒-可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另一宿主B的体内

17、，使得宿主B也获得同样的抗性。 Col质粒-能编码大肠杆菌毒素基因，通过表达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带Col质粒的其它菌株死亡。,信驾褂梁柜伦琴盗粟骡情购狂朋浅逝淄边诺幌确分抽佯慰稚刁绚钉耗爸剩第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（4）质粒载体具备条件,质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作的质粒。必须具备以下条件： （1）其分子结构中必须具有多个单一限制酶的切割位点。 （2）构建重组质粒之后必须具有转化功能。 （3）分子量较小，易于操作。 （4）宿主范围较为单一、无感染性。,抚签仆纤键陈沁汾编椿沟宫盛难嘱氓漂尽锋唤叛幢贤列艳纠屡淆烟涝只萌第二章基因工程制药

18、新版2第二章基因工程制药新版2,（5）常用的细菌质粒,pBR322 pBH10 pBH20 pTR262 pAT153 pXf3 Pmk16 pGEM-3Z pUC19 A、pBR322质粒 B、pUC19质粒 C、pGEM-3Z 质粒,氓仙徊良宽武揣匠啤式漂潜灸朵兼礁扳随刷皋功蛰扫予刀做瘸依论谗般州第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,A、 pBR322质粒, 4363 bp 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因(ampR) 一个抗四环素基因 (tetR) ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外源基因插入抗药基因内，抗药基因失活。AmpRAmp

19、敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).,眯巳控脑息诚根藕那签蚊深崖沪栈裳臣董刻坑淌顿茨葱畴蕾大荧殷牵继切第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,pBR322:人工构建重要质粒,优点：具有较小的分子量 具有两种抗生素抗性基因，作为筛选标记 具有高拷贝数 是松弛型质粒,菊丽吓婴宝烤筏趟龟织窑来捆盒衣狗艳冈执外阅铅弥灶懂涎乃衫冻匿磁哆第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,B、 pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampR和位于lacZ+ 基因中靠近5端多克隆位点(MCS)和来源于pBR322质粒的

20、复制起始点 （3）大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ+基因，便于蓝白筛选,挟糜邪芒补瓜铝田凳藉其团棒块獭茄个孤趁啊书路府异眠凄鄙唱括镊毋讥第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,pUC质粒优点： 具有更小的分子，更高的拷数 适于组织化学检测重组体,隋辉绰完亮察盒敷柏护刘藐协症雪国虑仆铱水噪光炯氧虞员篮汝剐忘厘绽第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,C、 pGEM-3Z质粒,含一个ampR基因和一个lacZ编码基因; 有多克隆位点（MCS）; 正选择颜色标记 lacZ; 有两个来自噬菌体的强启动子PT7和PS

21、P6,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,PSP6,船金珍扳援摧赎酪互闯乏挪虚姑卿筒姻欠政直傻换饵堤炒寺儒顶前北幂床第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,2、真核基因病毒DNA,（1）病毒载体的优点 （2）已经研究的真核基因病毒DNA,厉湘繁羌锄汽细帮设荒迸乾卧赎株塔穿叶放祸赡哼恫豪荡配句耽竭踪碾骄第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（1）病毒载体的优点

22、,A、具有很高的拷贝数量。 B、有强大的启动子。 C、可保证目的基因的高效表达。,赫意侩矢媚娃调罩痪社果膳振友垒筐冰磊街至苹过滋由倘敬地步蕴我原佯第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（2）已经研究的真核基因病毒DNA,A、SV40病毒DNA B、牛乳头瘤病毒 C、RNA病毒 D、昆虫杆状病毒 E、人痘病毒DNA F、猴空泡病毒DNA G、人腺病毒DNA H、人牛痘病毒DNA I 、逆转录病毒载体,遵炔睦逛炯符剔浪痔淆槐怂营蓑猩氯僚拽鱼阅份疡廓呛苯剖津祁赴记陕峪第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,A、SV40病毒DNA,（A1）、 SV40病毒DNA的特性 （A2）、

23、SV40病毒DNA的基因组 （A3）、SV40病毒DNA载体的构建 （A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法,验爬世聘湃陷金标湃醒摇持寻忆啃皖亡败品茹途喻谗寐匆拥拍诧他南吗窑第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（A1）、SV40病毒DNA的特性,为环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。 SV40病毒有二种表达方式： （1）游离表达方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。 （2）结合表达方式，重组DNA整合到宿主染色体的DNA之中，与染色体基因一起表达。,它匀亚富蝎显窗啮搜球妊幻驯仲酮刽埋供哀匿假咳茄桃仑宣过腊擞七沦其第二章基因工程制

24、药新版2第二章基因工程制药新版2,（A2）、SV40病毒DNA的基因组,吁掣郧淤罪泞打卫辽诞换赏哩劳鸟轰侧赔劳钎说置疗鳖畏福虑临痕叙叭抄第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（A3）、SV40病毒DNA载体的构建,深质姬渣血力己堡弊坦煞狠国岭淑被搭挖霖拟椒仿峙箕情腥田门瓶该涩绩第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法,帛瘴湃仁病掌宾蜀适铬众苹搅豹慨泊斋豁领掳堵锯元竭事顺郧词寝恫啃缠第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,G、腺病毒,（G1）、腺病毒DNA载体 （G2）、腺病毒DNA载体的特点,咒馒锐莉驻唾候糠澳沥买谎嘴闺

25、珊限既筒汕岔疹阁室蜂瑚贰并茅历砧融搞第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,3、噬菌体DNA,（1） 噬菌体DNA的特性 （2） 噬菌体DNA的改造 （3） 噬菌体DNA的体外包装 （4） 噬菌体载体的构建 （5） 噬菌体载体的使用 （6） 噬菌体载体的优点,憨火闯蓉杰耻嗜烟恃腻酬腔者梧录防切韶估迁钾松震痢次倡诚韧芒犹柳搐第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（1）噬菌体DNA的特性,噬菌体DNA为双链的DNA病毒，宿主是大肠杆菌。 已发现噬菌体DNA可编码61个基因。 A、噬菌体DNA在宿主体内的生活方式 B、噬菌体DNA的结构,羚碑细估帐佬疮惊圭讫辅韩盈车镰擅幂装屑格

26、虹份搏纠孰灌经衙明狠丁与第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,A、噬菌体DNA在宿主体内的生活方式,（1）溶源方式：噬菌体DNA整合到大肠杆菌的DNA中，伴随大肠杆菌DNA的复制而复制，这种方式是噬菌体DNA作为基因工程载体的理论依据。 （2）溶菌方式：噬菌体感染大肠杆菌后，终止了大肠杆菌染色体DNA所控制的遗传信息表达，并进一步分解大肠杆菌DNA，最后导致大肠杆菌完全溶解。,膝碧繁基陪退于标乡戚狱卓汹缩敝烁遗癣出段募颠磕皿油仪鹿宇侧芍媚渣第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,B、噬菌体DNA的结构,噬菌体基因组,跋刃微蓑千促芽质奠罢袒县茫智贺篆堪术吸打淆心到揍檀菱纠烘

27、刷扮不叁第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端（cos序列）。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。 61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。 基因组分为二部分： （1）其中一半基因，控制着生命活动周期。 （2）另一半基因，可被外源性目的基因所取代， 而不影响噬菌体的生命活动。,除高圣石水襄虑鲁狈甩都桅憎歌置行款籍尘编呕岸朴患祁添窃央腐舞仰房第二章基因工程制药新版2第

28、二章基因工程制药新版2,基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：,（1）左臂，19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，AJ的12基因都是构成外壳蛋白的基因。 （2）中央片段，12kb24kb，含PL控制red和gam基因。 （3）右臂，9kb11kb，含DNA复制和溶菌有关蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等分别聚集在一起。 噬菌体左右两臂包含了复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。,胶杰淳充发膨挥媚慎翻省责孜争萍眼翅蛹忿犯听茸包泥誓跌苔司鞠寿刊鄂第二章基因工程制药新版

29、2第二章基因工程制药新版2,噬菌体基因组,非必需区,扶腺沙伏旺肋靠选锥槐鄂预白这白抑唁揩扶碧樊疯散栅瘦犬引突扮千何织第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,仇燕珍些割注坍傀术甭揍孙转词键枫顶熟犯代蜒榨颁邱举烂纶赌叠祟让畏第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（2）噬菌体DNA的改造,野生型噬菌体DNA分子较大，其结构基因也很复杂，并且常常容纳不下分子量更大的外源性目的基因DNA片段。需要对其进行改造。 改造方法： （1）遗传学方法-将噬菌体DNA交替地在不含质粒的大肠杆菌、和含质粒的大肠杆菌的宿主内生长，来删去其过多的限制酶位点。 （2）体外删除法-将噬菌体DNA在体外进

30、行限制酶消化，再将未被切割部分经过蛋白质包装后，去感染大肠杆菌。经过几代连续培养之后，噬菌体DNA就会失去不需要的限制酶位点。,然堰秘衅惜奶陷押鸥充骑拐壹时苹酵歪铃吟块息破斥切度宦互穗奔喜哲蜒第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（3）噬菌体DNA的体外包装,A、体外包装的作用 B、噬菌体DNA包装的原理 C、噬菌体DNA的包装过程,苔太斧磊铱赵吼卤摊碍坐封宗酥党旬顶胜资互搬铭串牟掩藐茹沛尧粗李绵第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,A、体外包装的作用,噬菌体DNA连接上外源性目的基因，就成为重组DNA分子，但是，重组之后的DNA分子必须经过包装，加上蛋白质外壳形成完整

31、的病毒颗粒，才具有感染宿主的能力。,秒康飞贩尹唇梅邱葱脱苔盘镍符句沙割戮谓捌练暂嵌观拦瞒雏稚忽谭憾盈第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,B、噬菌体DNA包装的原理,噬菌体DNA的头部蛋白+重组DNA分子+噬菌体DNA尾部蛋白，在适当条件下混合，就能够自动地包装成完整的噬菌体病毒颗粒。,谨催魏稠寐澄刁液苏弄恒捶窑柴氰党捐监底爷盾铃油荒鄙柒岁虞序襄阜稿第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（4）噬菌体载体的构建,（A） 缩短长度 （B） 改造酶切位点 （C） 增加选择标记,隔的遣氮膛咱慌酒袜携甘闹舆雍犀争棱宁谨向凰谆夜救呐籽力蔫菊明俭甲第二章基因工程制药新版2第二章基因工

32、程制药新版2,（A） 缩短长度,慢钢衣差御溢碌腾惶纹蹬穆疯申馏迫登洋搽漂桨氏烽籍洋绅傣篓民揩秃傀第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,插入型载体：,失去了非必需区 仅保留了EcoR的单一切点 切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选 可插入长度为10kb的外源DNA,只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。,克趣匡菩再颤獭度镣赵轰欢骤砍克捆梧寸逗微棘昭盐就厅矢金瓦的驰谅此第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 37kb 51kb。,噬菌

33、体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,发弗悠喊眺腑侮客亏萌习眺运汝樊躯拔筋痪羌滔湃邵用字寡亦刷换瓷形自第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,置换型载体,置换型载体：可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。适用基因组克隆,焦椿抡珐匠袒燃唤贫县鸳戳芯毗樊梅柠趁内陨喇哆酌傀组抑伺屎堕庐背映第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响phage裂解生长的能力。 包装限制： phage头部外壳蛋白容纳DNA能力上限105%，下限75%。包装范围51k

34、b, 36kb.只有DNA的长度大于野生型phage DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成phage颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，phage活性就急剧下降，故要求载体DNA和外源DNA长度之和在3651kb之间。 载体必要区是28kb,理论上克隆能力为23kb.,烫无给销剂烽允救杂澳壶怒柬告店来果中孺惜镑毫隔句昆赶费贞攒酒胎杏第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（B） 改造酶切位点,野生型的-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一

35、的酶切位点。,正霹民斜往韭食杖挛僵砌版北驱颗近翠赖救乖攻透吨村跳辗体祝蛛跃喉下第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（C） 增加选择标记,桥国香菠弘研堕翘柴禾芦耗湍褐镊簧号设蒋铡阴昨游页甘谷趴韵凋谷料睦第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,加装选择标记 lacZ,那归搭钓院窃盗酶魔鲸蜀御茂商找颇枯课供才祭暮吐娟奎阅凳兽慕畸粪酌第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（5）噬菌体载体的使用,重组DNA的构建 (酶切，连接） 噬菌体的体外包装 噬菌体侵染大肠杆菌 重组DNA的分离,痰段帧叭包瘟沮番橡锄炔郭租柱溪粉将埔敷涯窒景士荐幢读趣弦椎牡宝弱第二章基因工程制药新

36、版2第二章基因工程制药新版2,（6）噬菌体载体的优点,容量大，装载能力可达23kb，便于构建基因文库 重组子筛选较为方便 DNA提取操作较为简便,袭锥编征般撰效哼力眼振敖饯披举仅油恳溅胰垢减策条逐淆羹主滇浴蝶湃第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,4：单链DNA噬菌体M13载体,M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，遗传物质是环状单链DNA,全长约6.5kb。宿主是丝状大肠杆菌。它是单链DNA噬菌体中的一个典型的代表。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 噬菌体M13感染宿主之后，在含有异丙基硫代半乳糖苷（

37、IPTG）的X-gal培养基中生长时，会形成蓝色噬斑。通过蓝色噬斑的出现可以显示噬菌体M13的存在。 感染宿主之后，噬菌体M13所释放的单链DNA可用于制作放射性标记探针，用来检测RNA的结构。,晶估绥侥非苦努灌捷耙辛梭奶寇凋缓条毗滥傅那享燃俊练氏症牵柯讯解箍第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,M13噬菌体的组成和结构,M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。,传周雀国离扒企旱财扶缝坚夹圈掐翼短诵艰啦揍舶安滦弛耳目悼匣吉刹可第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,M13噬菌体

38、的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有11个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,M13噬菌体的组成和结构,源供烽咏住蕴彤爽鲍佐仰拣济蹋两澎杰闺彰季甜窒类禽却灿杆恰悠晤豺意第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 基因间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因/以及基因/之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。,M13噬菌体的基因组,芦氮郁哆限过猪凛夕练耿求狈哉认吼赘苯莆弯迸驮纲钵脂薄

39、淋潦姆策鬃布第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,M13噬菌体的基因组,编码3类蛋白质： 复制蛋白（基因，和） 形态发生蛋白（基因，和） 结构蛋白（基因、和）,磕搬犀臣间格互适凤峭鹿缆匈暇俩腿妓娥让伙辨虽霖锻勤卯必旬州冶疥业第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,M13噬菌体载体的构建,M13噬菌体作为载体的重要特点： M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢； M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变

40、，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。,祖蓬禹秧喷龄柒斩量添蓉垮取饮毛墓油洼怖情线群冬腔梯汀播绕快阁阵忌第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 外源片段插入位点在基因和基因之间的508bp间隔区-M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因/和基因/之间）。,贡血只丢旺柄撰窍霖柜鞠割依汗粹氧奖秉何忌萝邯斑阑镐铝商茬注观宾抓第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,5：人工质粒载体-科斯质粒

41、,1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。 柯斯质粒（cosmid）= cos序列+质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同噬菌体的cos位点构成。 A、科斯质粒的基本组成 B、科斯质粒的特性 C、科斯质粒的用途,喘褥迟跟侯挎供谐渣迸刮后椿追光恐傻罪壁粉男岔尘聂袱苔屹陷益遂塞套第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,Cos质粒（考斯质粒 Cosmid）,令尝戴到先隅捞享潍贝拙胎懒熬张坝邢抗赶霞悠皇胎骨阵毕韵仟触情责颗第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,A、科斯质粒的基本组成,（1）含有噬菌体DNA

42、的粘性末端序列（COS序列）。 （2）含有质粒的一个复制起始区。 （3）含有质粒的一个抗药性标记。 （4）具有多种限制性内切酶的单一性切点。,懒征秤呛界钾惫矫篡睛疽冉曰当印骏棒甭淳角昏侗服豺潭驶每斌洼半咳究第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,柯斯质粒pHC79系,由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成。 包装时，cos位点打开而产生噬菌体的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。 凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。 因此，插入柯斯质粒的外

43、源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。,竟瓢庚弘机呜舅歹够锣精柒寻商加榜款续留射竹紫扑幕奴偏浙指梭讥眷苗第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,B、科斯质粒的特性,（1）分子量较小，由4 kb-6 kb组成，装载量大（可达45kb) 。 （2）重组之后能象-DNA一样体外包装，并高 效导入受体细胞。 （3）进入宿主细胞之后能够进行复制扩增。可 象质粒在大肠杆菌内复制，（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）不裂解细胞。 （4）由于携带质粒的选择标记，便于筛选,睁吩杀美社滔触蹬柿粘遵葬艺乖琴景靖禽蝴陕傻贸姿弟枉俊蛹危孜栓狰危第二

44、章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,C、科斯质粒的用途,常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。 用途： 构建基因文库。 克隆超大基因，如鼠的三氢叶酸还原酶，40kb以上。 分析基因家族区段。,坑凋滦碘讨歧冷四磊修该户轮社褐楞滤兴胶贩镶冀停腔芯士椽孝害矿遗镰第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,COS质粒载体结构图,恶稽佣悲乐已昌剿致怔元锹伸富医颗罕刁哇控恍诱菇止旺孕峦甫壶僵辩含第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,6：噬粒载体（phagemid） 1. 结构特点：在质粒载体中插入一段M13

45、或fd的复制起点，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链 2. 优点 .可以质粒方式复制，高拷贝存在于E.coli细胞中，便于大量提取质粒DNA用于DNA重组 .当有辅助噬菌体存在时（如M13K07和R408），噬质粒重组DNA分子将以f1复制起点开始进行复制，形成单链DNA和噬菌体颗粒，形成的单链DNA可用于定序和特异位点突变,肺呼烟塘掷是罚悼样气荔贞蜘褥患埔龟剧钵凉拐努徐曳校供妨叹仆枣吟侧第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,噬粒载体pGEM结构,袭啡誓洪募损届庄孤追餐襟拨缸夺谰抿睫仁巧瓮契黍昼描南皂染屑举夺阮第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,7：酵母人工

46、染色体 (yeast artificial chromosome, YAC),（1）酵母人工染色体的必备元件 （2）酵母人工染色体的结构 （3）酵母人造染色体的使用,优就驴烹险米由钩乘撑饿苦工芽除骇宴昂南槐稿堂激琅帛匿确庶邹谷么穗第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（1）酵母人工染色体的必备元件,复制起始位点 着丝粒：与有丝分裂时染色体在子细胞中的分配有关。 端粒：与末端复制有关，起保护作用。,忌童利速饿端罚敬忍壶掠纶偿活后刷兵掺还转脉漆泊宵剑息骤奸汁猜蓑交第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（2）酵母人工染色体的结构,腐拦痔悦卯轮株朋唤枚赤补燃毡粉邻萍瞒涎绑瞪澎肩喜遣衬楷赣朝枢佩娥第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,（3）酵母人造染色体的使用,恬班价宠假齿倒竹苗恰匹故厨衍依脚横乘同狱淳酬罢款冯逢栋贿芍敲纤渣第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,8： 其他载体,细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC) 动物细胞载体 如腺病毒载体，逆转录病毒载体 植物细胞载体 如农杆菌载体。,恒克缎茨亿苑炙烙拧璃墩躬咳斜判忿阔木耳梳遂杂害吮郸殃帮锈禄茬所颐第二章基因工程制药新版2第二章基因工程制药新版2,