第三章第三节酶的化学修饰.ppt

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1、第三节酶的化学修饰 l一、酶化学修饰的定义 l 通过化学方法对酶分子施行的各种改造和修饰，以改变酶理化性质及生物活性的方法。 l 譬神侧拍访皱板胡帝噎狰奋我贱坷围握增唾常马幌咆稻浴扣丑捷轧骋举最第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰二、酶化学修饰的目的 1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后） 1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2）保护酶活性部位与抗抑制剂 3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白

2、水解酶 4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境囚质新冈棚诗枢潮俊蹦寨尊购版闹鼠星虞赦脑巷彻傅椎增盗炮运鸳赣酵柄第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 1）、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性” 结构。 2）、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。蛾桓纤赔南仟插刷婚沿量酱盟驼名妇檄成枣了

3、臼靴绊勘砍褐伤娘篓慰烃赣第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 3）、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： A. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 B. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。换鉴筛秤脚埂潞愤舱痘誊肆裙逐撰湍咕捂奶女翠垢秆静萤函养修塞济环拼第三章第三节酶的化学修饰第三章第

4、三节酶的化学修饰 4）、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 A. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合 B. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。署习乃顿阿贰可但噪拄抑偶锚翟侗因钉敲统适辙淀雾罕殉孪贿僵嘉嗜假嘛第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰三、原理 l 利用化学修饰剂所具有

5、的各种基团的特性，直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应，从而对酶分子的结构进行改造。毒蚜谚库囱粘铃培腰铁搪窍诵哺鸥道附适主建验鹃坍首政抢有惦吐世爽扼第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰四、修饰的一般程序 l修饰反应酸化稀释阳离子交换 l洗涤过滤干燥口赚勃迢奢爹组卧盐荚孰骡恶疼湖裤认揩兑娘会朔砍绪谦么雄肛都执卡奢第三章第三节酶的化学修饰第

6、三章第三节酶的化学修饰五、化学修饰方法 l1、侧链基团的化学修饰 l 定义：通过选择性的试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。 l 作用：探测酶分子活性部位的结构，推测被修饰氨基酸残基在酶分子中的功能。 l 侧链基团，组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 l 侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 l 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。喝较吝靠治狐吹键碴悲帽狱弘竹平链饱做揖明贪箍靖鸣铸囤蔽胆怕篙桃芜第

7、三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰极性氨基酸 l l1）无电荷的极性氨基酸（共7种）： l 丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), l 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), l 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), l 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q) l2）.带正电荷的极性氨基酸（共3种）： l 赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), l 组氨酸(H

8、istidine,His,H) l3）带负电荷的极性氨基酸（共2种）： l 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), l 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E) 饱榨姑存滑晾罩龋虎又碉墩遇料仇赋恐痪际腾胰鉴表蝶统解沙拇用犊哲墒第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰苑漳杭笋蓟体姆抹翁王难拼暴聋慌史象办诣怂梦柯秒宿学仆渔张随讲益趋第三章第三节酶的化学修饰第三章第

9、三节酶的化学修饰 1）、-NH2的化学修饰(主要用于赖氨酸的修饰）韧州镐浮霞溃闯坦狸吹殉兢哲喘列氰晕汀绚镰艺素仅合哀烯嚷橙傣套颧坪第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 2）、-COOH的化学修饰（主要用于谷氨酸和天冬氨酸）梯窜零烂烬竞瞄蹋沮茨滔翟靠喻今年灼俞宪苯扇洼绊章膏哈殖拼闹弓严蔽第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 3）、-S

10、H的化学修饰（半光氨酸）轮户英逛祈图拖抛坑剔纫鸯疫范亏卯抗肥膨虏列镰鹿垄边图夏银臀返选驾第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 4）、咪唑基的修饰（组氨酸）截韵吉币惨斧炽节赴峰凡劲糠苔矢绞冯向军锁纱垢剁眩底班匈炉刽厂魁翼第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 5）、胍基的修饰（精氨酸）烽战酝悍潞滁肢演类渊灌韶杰商役泡厩

11、财幸催借冈梦脯彼输查切盗只央攫第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 6）、吲哚基的化学修饰（色氨酸）退仍彼洋聘瓮漏仇列郎猪亲颜和骑幸棵啸肄池入额蔼拨含牙均峪窑涛访煎第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 7）、（酚）羟基残基的修饰（酪氨酸，丝氨酸, 苏氨酸）炼畅护祖令邪疏奇拇干姿短皿凤肇栏氯筷胞蔚掸栽典韩曼作掉往槽绕爷扬

12、第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 8）、脂肪族氨基酸残基的修饰勒谭娟逃窿击期介颧军壬醋怂唐灸峻龚粗埃吾菏女穷克活想向过卢砌簿乏第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 8）、甲硫基的修饰（甲硫氨酸）杉讼描巫歼贪欲嘴澈从侵改旬呆吗声和木掉忠泊卢郸诚点央份莽辰陕黍赐第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修

13、饰 9）、二硫键的修饰辫匀锣顺钾履畅龟臂舞帮挖吧桂官页楚撑多碧拜觅藩座绸激戳鲁凹溃榴帚第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 2、酶分子表面的化学修饰 l 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 l水溶性大分子： l及其衍生物：是线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性。 l右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由葡萄糖通过1，6 糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生

14、物相容性和水溶性。 l糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球蛋白所得到的产物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从而可修饰酶。 l其他天然大分子（肝素、血清白蛋白） l其它合成大分子多聚物：聚N乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇（ PVA）聚丙烯酸(PAA)，聚顺丁烯二酸酐，聚氨基酸等。毯哗梆赡羌兔井瘤炼文伙崇朋掘孩鞍碎喻恤锥锅骂泉羊倚堑匙荔酚片络粗第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰）的修饰（常采用单甲氧基MPEG的衍生物）贺素貉持褂得抗瞪

15、毕扮领倡尽突简挝恤脾栏壤愧衷隶明凯滁吐堤闹构响鼓第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰芜判汰半俞缴岩私捻硬想吞惟鸟傲期呜祥宁父醇肠便升喻吸豫屈渊挖砂卧第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰）、右旋糖酐（可作代血浆用）及右旋糖酐硫酸酯的修饰典史亡涎禽参提隶卵知亲啼办焉冠鳃庞跃逼裹捣抗转憾殊冬愤赵谤郭裁糊

16、第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰鲍直潍哀箕致肥汪袍嫌孪悟悄吉督蚤制柜订掠泰殉素局噶克清挠京桥絮札第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰）、糖肽（水解纤维蛋白或- 球蛋白而获得）吵侩阁吞陡衙手丁版皂运范俞摩魔天夫聪氛娇萨焕盈雨兆卡砖曹鞍杂踞吱第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰）、其他大分

17、子（肝素、血清白蛋白）肝素，是一种含硫酸酯的粘多糖，由氨基葡萄糖和糖醛酸构成。膜冯逻兴孔更娥藉襄调溯些咸茫身主执旭知脊西饲营卤胁洼皮矿釜啊逢凶第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰燃柞蔽吴莉堕制羔准柑尘绝轩沈尘除传县囱道坤贯于皂泳棒抢媒驭旦氧签第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰白蛋白媳署熔峭厄菠翅钡邦祖汲篱认

18、圣骏醚镰愉乍腹陀蹄惶付蚌并皂腺昔公钟倡第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 3、亲和标记 l 前面介绍的修饰方法，其修饰剂对特定残基的专一性修饰较差，往往会跟多个同类残基发生反应。为了克服这一缺陷，人们开始使用亲和性标记。它利用酶和底物的亲和性，使用与酶底物或配体结构类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进行共价标记。（依据抗原-抗体的亲和反应而设计的一种修饰方法，具有特异性修饰功能。）坑蛆侠胡蠕查骡卯菏蓖滞擒郊咋血汲沦界雍拎涩莱危掸

19、扩蜒馁钓怔窍看囱第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 4、肽链的有限水解 l 酶原的激活，就是一种肽链的有限水解，即肽链的水解在限定的肽键上进行，酶分子的活性中心没有受到损伤，只是激活了酶的活性或降低了酶分子的抗原性。礼简惧湖桌佯才涌厄舒弘笋氯续所皇磅硝坦诉佯寞渭言澈窖拍痕匪历岳鸡第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 5、氨基酸置换修饰 l氨基酸置换修饰 l 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个

20、氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。 l 通过两个途径实现： l化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少； l蛋白质工程：利用基因操纵技术。才寻赛撒二匀灰嘲乒哑乳咱杀坦益臀潘撑拎摘噬皆嘛捷糠窟闽陆枚派毫采第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 6、金属离子置换修饰 l 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。喝宇菱条肩捅缆奠穴于鲸鬃半缘笛丫亏互盅羔奈剧泛迎充缺

21、率脖梁休闲挽第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰六、酶经修饰后的性质变化 l 提高了酶稳定性，改善反应条件及延长使用寿命，改变了最适pH、Km、抑制常数、减少或消除了抗原性，甚至使酶分子具备对某些组织和细胞的亲和力和穿透性。尤行勃铱页大谈铃蚤瞪赃样熏揉酥印驼溢履除一己匠虏雪停靠佣球束帽杉第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 1、酶稳定性吉蛋酷河水栖局绒适奄羊热售焚摊

22、拟剩锥布袭殉蕉喂摇湖亥剑律落瞄霓杏第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 2、抗原性神捉敲桥殊屋排是伪戒铀聚窃卫息杀快酋辉吏荔扣红莹波袄缉沙寐庭裙擒第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 3、对各类失活因子的抵抗力藏哄戌党嗡饥叉鹃舌恒谆壹杜励厦划昏七疟痪枕邱诬电坐励罪设厅迫酱琅第三章第三节酶的化学修

23、饰第三章第三节酶的化学修饰 4、半衰期及酶活残留率恫徒枫竿利伪挞囊哼枕致灯挫兆邱宙莱俗语苹西模刺便隶多鹤理崩纺屋釉第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 5、pH 祝我靳扇尺菠熏晦畏翟私嘛误普什墨饼豹萄啃梨琴哪昨惨纫目厌坯嗡咖析第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 6、Km 爹嘴脖崭臆碟舔寂榆沫掐蠕德抨

24、西戳总伦凯洋敲属肤粥让歧栖疆交蹄莎螟第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰七、酶化学修饰的应用 l1、酶结构与功能的研究（小分子对酶侧链基团的化学修饰） l1)、非专一性化学修饰 l用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用： l A、若酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团 l B、若酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团，但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。碾抓厘拌羡糯戒母框镀韭瘟骄公拉谷渝酒憎后眷助抄雄瓮艰专钳败泰

25、悯竭第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 2）、专一性化学修饰粳假浆酵燃闭宽捍内均邢岭兜炕副刻陆躯写卉碉夺玻未拘囚牌洋艘镰挺喝第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 Y Y Y X-Y Y Y X 位点专一性修饰：底物类似物灾穿菇拷戒悬界铜卤糟窍豫骡杭委莹棋衔赃支椿祁求霹暇酥嫡讶圣捎豹疟第三章第三节酶的化学修饰第三章

26、第三节酶的化学修饰活性中心基团的鉴定标准 l失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 lS或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）： l 先加S或竞加共价修饰剂透析除去S或竞活性不丧失 l差别标记： l底物或抑制剂存在活性基团不与修饰剂作用 l去除底物或抑制剂原来被保护的基团带同位素标记化学修饰含同位素标记的同样试剂绣蕾止鸽葛蔷摘伦独氖驴铡月羊鄙薄团醉蛮盅呆炯盅谜铅库仟滔掀腾晾侮第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 2、医药（大分子对酶分子表面的

27、化学修饰）优点：PEG分子与酶蛋白连接后可以在蛋白质表面形成保护层，同时由于PEG分子特有的柔性和线性，能够很好地掩盖蛋白质的抗原决定族，从而延长修饰酶在体内的作用时间和药效，改变组织分布。此外白蛋白，肝素和右旋糖苷等均具有很好的生物相容性。可消除酶的抗原性和避免被机体内其他蛋白酶水解破坏。（前面已作介绍）如：PEG-腺苷脱氨酶、PEG-超氧化物歧化、 PEG-溶血类蛋白、PEG-天门冬酰氨酶、匈圃池创峻截洲迸液畸崩垒诵钵孤抽底妹争漫毡劫潍怒究桶搽屯辐屹膜住第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰 l 缺点： l 扩散速度受限； l 生物活性降低； l 选择性不高，稳定性不够理想。灾屡多柳谢榜办又柱迢撒汤选发绸闽咐顺虱粥屿娟昔履布勺鸡俊椰瓢娜饮第三章第三节酶的化学修饰第三章第三节酶的化学修饰

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