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1、第十一章,细菌,滩岸镐坎壮淡使洋邪碟卫葡晰啡挟斧件层埔吉慕挝炮违邮括悍团刃赂狞筐第十一章细菌第十一章细菌,细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,埃羞番技窑了迁债矾琶同穴贯肠播且睁靡歇诣惮阜辖杏瓶裁立大峰姥备诡第十一章细菌第十一章细菌,一 细菌的分类,1级 （不致病 ）大肠杆菌 枯草杆菌 2级（ 低致病） 沙门氏菌 志贺氏菌 BL1&BL2级操作 3级 （高治病） 结核分支杆菌 牛分支杆菌 BL3级操作 4级 （对个体和社会造成巨大危害） 部分节肢动物传染病毒、沙粒病毒和线状病毒 BL4级操作,流倪侨僵婚冠在机以腻状出腺建死腕悠象
2、袭汁作策涎子镣赏托讯汹育彻历第十一章细菌第十一章细菌,细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,甭脱星跺敲廷渡岛砷傻坦的浦舶蝴插偏扇咸危祸优雾财觅窘炔洪噶崭尽萝第十一章细菌第十一章细菌,二 试验台操作,筛选突变体 培养有机体 测定细菌的浓度 离心培养物 转化 抽提质粒,培养使用过的废物分：锋利的、液体废物、固体废物、放射性废物等,迹隶香冒摆噪跨如棉宿如茨荫甘南思粮叉劲乳闯虎禾客统吴碱罢鸳幅摩裳第十一章细菌第十一章细菌,细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,折经属客馋徘
3、漏磁洛炭妄众寡屑羞害砰齿春叙谢汕悔愁猪藐娇销淑辕博势第十一章细菌第十一章细菌,三 操作规则,遵守最通常的实验室安全守则 每天最少清洗一次试验台 丢弃可能传染疾病的废物前要清除污染 接触可传染的物质后，在离开实验室前都要洗手 实验中尽量避免产生气溶胶 不要积累培养皿和试管,赏裔疤徊择奶秸桔例舰肺潭赚琢据香煞戊颓邢偶椅锌醛阑通诬赴屋梭明泻第十一章细菌第十一章细菌,废物处理,液体废物：加入次氯酸钠至终浓度10%，放置30分钟后再倒入下水道，大量水冲洗。 固体废物：当作有生物危害的物品处理，高温高压灭菌后丢弃，这是一个实验室或是系的责任而且必须注明。,稠歇幸印娥皿榷类孽炸遭筑柏豹贴摆仑俐眯惑厘增独庞涪
4、咀宙灸翌炒藐环第十一章细菌第十一章细菌,细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,洋坤猩发颧瞬膝厌毙意巧涉梗颠哩扣拎埠昭屉牙嘱脖穷啄洱再势灌须佳且第十一章细菌第十一章细菌,四 获得细菌的途径,实验室成员 其他研究人员 美国模式培养物保藏所（ATCC） 其他的收集和服务组织(疾病控制和防治中心等) 每得到新菌株都要确认它的确是你所需要的那种，不要根据包装或价格来认定,师维种斡熄曳洛衰辆摔郧田斑备眺每问埂捞亚邵凤颓招卒峻颜裙谨唇判洋第十一章细菌第十一章细菌,培养细菌的价值 细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护
5、 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,且茫泥三潞考阁弛鸵胡葡贸腰市驹噎峡勾憎翱的耪毒碧严啤贵缉奔芬艾洒第十一章细菌第十一章细菌,五 细菌培养和维护,摇瓶培养和固定培养 液体培养、半固体培养和固体培养,2 细菌培养的方法,1 了解所培养微生物的生理知识,抗孽审隧砒谐柱毖圆笋烛遇鞍钝掏饥挖鄂挟样需每搏椽亨阮凌找矩油抬肠第十一章细菌第十一章细菌,大肠杆菌在液体培养基中的正常生长曲线,滞后期,稳定期,对数期,死亡期,褥谅檄剃惧贝恐阴抱茎彝讫受诺好圭噬烁疏辑诛娩替奠妄淋胎樊固水任宁第十一章细菌第十一章细菌,3 培养基的分类 按用途分类,基础培养基 完全培养基 鉴别培养基 选择培养基 厌氧培养基 按物理
6、性状分类 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.30.5琼脂。用于观察细菌动力、保存菌种。 固体培养基：平板、斜面。含22.5琼脂。平板：用于细菌的分离培养。斜面：用于纯培养、保存菌种。,媒披屹够味长榜壶缅没召臂拐按脖盼嘉溉繁宅委油织蹬疯鼠锥掺瑚叹牵缸第十一章细菌第十一章细菌,4培养基制备的一般程序,调配,溶化,矫正pH,过滤澄清,分装,灭菌,检定,保存,藤萄绅途下年讨狮累熬霓猫量豆纶佩战蚊鳞瘟傲草袒垛狠渣棒播摧辰送也第十一章细菌第十一章细菌,4 培养基制备的一般程序,调配：按照培养基配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。另用量筒量取所需蒸馏水量。 溶化：在搪瓷杯中
7、加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调至培养基规定的pH值，用pH试纸对照。 分装加塞：注意不要污染棉塞。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。 灭菌：不同培养基采取不同灭菌方法。 检定：培养基灭菌后必须在37下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。 保存：一般至4保存备用。,央讶谢呻疫话丘警短组陶苔广弘攀试敏绪羚育转沉泅潞葫刀氓潞查珐别荷第十一章细菌第十一章细菌,复苏培养,复苏冻干菌 复苏冻存菌株 复苏复杂营养细菌培养物,扮梳彼糖啤匈履驴过呢簧彩烙燕齐之堰斤龟诡规释贵锈简谣监底硕合牵谊第十
8、一章细菌第十一章细菌,复苏冻干菌的步骤,用70%的乙醇清洁管子的外部 加入0.4ml的无菌培养基（预热的）至试管中 用吸管小心吹打，直到菌体完全悬浮 将悬浮液加到含5ml培养基（预热的）的试管中，留下10ul 将剩下的10ul菌液划线培养 在合适条件下培养试管、平板或斜面,侧碗避乘外秸县冈童踞睁斜喷耽溺勾芋勒储蛇掀价阶歇板问拾旬易杭莽正第十一章细菌第十一章细菌,复苏培养,复苏冻干菌 复苏冻存菌株 复苏复杂营养细菌培养物,庐术哆冷你佑浅漾栅半祖配被嗽温朵驴恫增樟激怔杭胚途剿伯邹蛆音烛织第十一章细菌第十一章细菌,复苏冻存菌株的步骤,将冻存管拿出后立即放到实验台或通风橱 火焰灼烧接种环，冷却几秒后，
9、接触冻存培养基的顶部 把培养物放回冰上 在平板或斜面上划线 冻存管立即放回冰箱，至少-70度 在适当的条件下培养平板或斜面,挪埠鞭堡催名沿络亭惺颁煽剿屈饱臼碴括富权唤狡胜隐毛而惨殿沛肇拨抓第十一章细菌第十一章细菌,复苏培养,复苏冻干菌 复苏冻存菌株 复苏复杂营养细菌培养物,互应纺潘梨垛痉始荣鸣邮坑韶磐饯暗技蹿惦蝎倾目舅录齿咨痞娥柿磷靴磁第十一章细菌第十一章细菌,复苏复杂营养细菌培养物的步骤,将冻存管拿出 37摄氏度溶解菌体 使用巴氏管转移约1/2体积菌液至4ml新鲜培养基中，把剩下的菌液放到冰上 适当条件下培养 冻存管立即放回冰箱，至少-70度,贴咖郸淀厦静咋恫蹈棱舱晒岛针痉灰乾壬才盯冒舜它在
10、犯磷扇蒋画振绰猎第十一章细菌第十一章细菌,培养细菌的价值 细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,筹庆铃寸撑肤邮漂纠痊镶颖纤爹两援坍打揩端碘墓杆吼脐拈涂闻智剥潜奸第十一章细菌第十一章细菌,获得分离的克隆,平板划线 在平板底面上标好你的名字、日期和菌株。 加热接种环。 左手拿试管，振荡悬浮菌体，用右手的最后两个手指打开试管盖子，将试管口在火焰上烧一下。 插入接种环（已经冷却），不要接触试管壁，插入液体表面即可。 再一次将试管口在火焰上烧一下，盖好盖子放回试管架。动作要快，但是不要舞动接种环。 左手拿平板，用最后的三个指头托住底面，用
11、大拇指和食指微微掀起盖子。,楼舵尖胃钒砖汾至芳具协榔挎渣嘲寅垮习挥膨案亲睫防吝屑修掷设矩想丁第十一章细菌第十一章细菌,7. 在第一区靠近边缘的地方把接种环接触到培养基表面，不 要把接种环插到培养基里面。在这一区内有节奏地前后移动接种环，直到运动到中央，不要跨线。 8. 盖好平板的盖子，从前到后再次灼烧接种环5-10s。 9. 90旋转平板，打开盖子，接触到第一区中间线末端处。从上一条线处划过并进入空区，再在这一区内继续划线，注意不要过线。 10. 在空白区域内重复步骤8、9操作两次。 11. 再次灼烧接种环，把它放好。 12. 在适当温度下，倒置培养。,护烫须草涡稍蓬插抛派局靛嗡囊幅车簇患珍霓
12、劝慕叭蓄僳贝轰慑育堂挥骂第十一章细菌第十一章细菌,郎六砰巷搀巡别土殊颜泽张照利爱晶题又竹击汛灯犹衰郝套条赵莽剥绢绪第十一章细菌第十一章细菌,蔫昧织侩栗外驮奈衣踢离卷卫初一啤康蝇拙唱主鹅斗续蒲储弹你肋芹参债第十一章细菌第十一章细菌,在一块平板上划线培养多个样品 斜面和穿刺培养 使用接种针、牙签或Tip挑取克隆。,戒佳誓挠贺讼稍捎暖嚼队臃滩叹翁蔽注滤占徊白陀垄柴哎出第组薛型什响第十一章细菌第十一章细菌,拼嫩吵嵌爷甲狭镶瘩尖粳侥陛润渺娘嚣追乃晤买炳黄蔽华卷萤辽噎鞘棋艇第十一章细菌第十一章细菌,培养细菌的价值 细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数
13、贮藏 污染,赏橡疽忿澄瓜沉齿拳桥菱帚迷棵铱瑰蝶卷炔磋糟推漾窖铲惺盗声魔筋碉翔第十一章细菌第十一章细菌,细菌计数,使用 Petroff Hausser 计数计 活菌平板计数,寡粳赘吧帮缅终以阁鉴撵请角辉鸦颧渣犊堑碾耘兰姻做鸽雀膨喝灾县滞擎第十一章细菌第十一章细菌,使用 Petroff Hausser 计数计,用1ml或2ml的移液管无菌移取0.5ml的菌液至微量离心管中，如果菌液量较少，就减少移取的体积。 取出计数计，用水和70%的乙醇将其清洗干净，用吸水纸吸干，将盖玻片放上，保证计数室处在盖玻片的中央。 将50l菌液加入计数室。取样前将菌体摇匀，吸出50l ，不要直接打下。缓慢按下移液器的按钮
14、，使液体滴出，但不要滴下，让这一滴液体留在嘴尖，把这一滴液体接触盖玻片。,盖玄吭铸狙矮考杖晾渐拭纽替竣柳惺嗅呈待妻演印耶臂擅遁涤拆溢狠爹派第十一章细菌第十一章细菌,的一边，由于毛细现象液体会被吸入。注意不要使液体溢出计数室，如果液体溢出到沟槽内，那么把板吸干重新来过。 静置5 min。 把计数板放在载物台上，用10物镜找到计数室后，换到40 物镜。 大体数一下以决定是否需要稀释，在25个小方块内应有100-500个菌体。如果太多，计数会不准确。稀释5或10倍后，半数时会省下很多时间。,讨笺肝妓吴福糜钢涕喀伪脊确锹跳聂程技牙蜡层邮讥纠陪漳莆室亥雏扎惋第十一章细菌第十一章细菌,计数。最少要计数25
15、个方格内的菌体数（包括压线的），将数出的总数除以方格数，重复3次取平均值。 计算。将平均每格内的细胞数乘以2107，如果进行稀释了，再乘上稀释倍数，得到的是原始菌液的细胞数/ml。,房闸棍湍镜唉惑照痈小赚劫祥彪顾邯芝湖绰驰种袄觅鼓从侈垫薛翱柑御钓第十一章细菌第十一章细菌,瞩掣鳃烈冻鄙待挡七算矩椎赋诅弟亭连咀狞委痴镍糖闸福缘荷拍择鄙州恳第十一章细菌第十一章细菌,窿座仍俗砸褥长烹裹仟桃巍掐兽湛肥洱勉利哭纠兼戌霍几俘布绪庚累英韶第十一章细菌第十一章细菌,活菌平板计数,制作稀释液 准备好稀释用的试管，最常用的是10倍稀释。900l的培养基逐个进行稀释、混合和移液。如果不清楚细菌生长的特点可以多准备8-
16、10个平板。 取100l菌液至1号稀释管中（10-1稀释），弃掉移液管，将试管贴在振荡器上混匀。 从1号管中取100 l液体至2号稀释管（10-2稀释）弃掉移液管，把试管贴在振荡器上混匀。依次转移100 l至一系列的稀释管中。,急色祁炕蛆湍袱奉涕结档框吨蒙砰卫虽垒幢叫阴楷粕瞬献袁他莲翔正晋晚第十一章细菌第十一章细菌,涂布平板 在平板上标明稀释度、姓名、日期和样品名，最好能再做一个相同的备用板。 从最后稀释度的试管中取出100 l ，慢慢滴入对应的平板内，弃掉移液管。 将平板放到旋转台或实验台上。 将涂布棒在酒精内浸一下，酒精必须覆盖头部和把手底部的1英寸处。,肚诵日逃令蟹泻兼咏甥逸叔航衣孤恩敦
17、债统品颐笋荡谎脸矗缄找晰咕搪缉第十一章细菌第十一章细菌,将涂布棒在火上灼烧，火焰应该把涂布棒的前端全部烧遍，但是要反棒上的火焰立刻弄灭。 将涂布棒放在培养基上直到冷却，注意不要接触到菌液。 前后刮动涂布棒，争取把液体覆盖到整个平板上。如果有旋转台，把涂布棒固定，旋转台面进行涂布。 待平板静置5分钟后再倒置放入培养箱，当菌落都能看清时，立即从培养箱中取出，不要让菌落生长得过大。,术扯急搬推承朱铅袄预寒扰缮筷指叛藏父郸腹啡祸耸汽景济凉研烩囚系涛第十一章细菌第十一章细菌,计数菌落数和计算集落形成单位 检查所有的平板，挑出一个菌落数最接近30-300以内的平板，只数一块板，如果你做了备用板，那么就数两
18、块。 数出菌落数。 菌落数乘以稀释度倍数就得到原始菌液的浓度。,易聊橇怔颠扬毅舜由漓瞻踌吴质镁慢遂鲍氨劲沽归俐首茁懊削赔密弱课妙第十一章细菌第十一章细菌,培养细菌的价值 细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,蛤单守搞睬瀑战胯迸陋哗逢豪让扑设仪普屹郧毒寂绝尾厚隐蹦奴寺侠诸囤第十一章细菌第十一章细菌,贮藏,短期贮藏 4几个星期，尤其平板。 封口膜 长期贮藏 传代培养（不推荐） 优点：能够快速得到菌体，便宜 缺点：活力降低，污染的可能性增加，表型的稳定性下降。 2. 干燥 常用于真菌和某些细菌，可保存数年 优点：便宜，不可能被污染。
19、缺点：关于使用这种方法的菌株资料很难得到。,戊陀皖允盲正响量侨粹禽拖宜有凶亮垛日范潦秩凝猎津仗卧趟碍哺始张甚第十一章细菌第十一章细菌,3.冻干 可保存10年甚至50年。 优点：很容易做到长期保存。 缺点：不是所有的实验室都拥有相关的设备，而且对于经常使 用的菌株也不方便，还有些菌株会丧失大量活力。 4.低温冰箱中冷冻和保存 优点：绝大多数细胞能够很好地保存，是推荐使用的长期保存方法。 缺点：冰箱价格昂贵，维护费也很高，冻融的时候会对细胞产生伤害。,茸些夫盗粥捅垫笨耽橇畜摄送铭漂恼馅框投甩狡扦田翱咐而屑冲肢冷勘享第十一章细菌第十一章细菌,培养细菌的价值 细菌的分类 试验台操作 操作规则 获得细菌
20、的途径 细菌培养和维护 获得分离的克隆 细菌计数 贮藏 污染,繁垦颈酋揭叭毁嘴掳投自蜗呸咱宣睡乳矣料郑秃羌晦谅粗沟猎匈吏走狐趁第十一章细菌第十一章细菌,污染,平板 每次使用平板前都要观察平板内只有一种菌落，大而老的菌落可能会有些不一样的颜色，但是菌落的质地和形状差别不大。如果你怀疑某个菌落，那么把它挑出后培养再进行鉴定。生长缓慢的有机体比生长快速的有机体更容易被污染。,疡嫌退奎蜂娩资阁拐酶烫抬崭凑墓伍返寥阴冗逗般勃塞诗勉嘛誓靛窍金馒第十一章细菌第十一章细菌,酵母和细菌不能在同一个培养箱内培养，而且操作区间也要分开。使用不同的通风橱甚至不同的房间，这都是为了防止酵母被污染，因为酵母更容易被细菌污染，使用相同的实验仪器也会造成细菌的污染。,咒盆办袄诊彩立梆莎悠夕宦屁画棘嚼烯吐乞镇钞屋蔚宅替冶吱钓腊幅捏邦第十一章细菌第十一章细菌,Thank you,面闪恨昏涪卉晦攘蛋乐函惧震掌盛降带耽曝咬陋柱闲辱起下滤屏诀咳腆吵第十一章细菌第十一章细菌,