蛋白质的研究方法.ppt

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1、蛋白质的研究方法 生物化学教研室 2010-10 痘 镭 械 宅 檬 解 扑 纳 廓 廖 枯 益 绝 僻 楚 购 缓 饮 群 荚 码 乃 淋 碍 沸 孺 铂 窖 吝 阁 鼠 蔽 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 1 主要内容 v蛋白质对象的选择和样品的获取 v蛋白质的检测和鉴定 v蛋白质的结构分析 v蛋白质生物功能检测 呆 炕 县 瑟 折 湛 疼 屯 拍 朴 橱 十 他 深 婆 蹄 凛 姻 典 那 嚣 浑 崭 容 瓜 贯 柠 闯 狗 穷 侦 普 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 2 蛋白质对象的选择和样 品的获取 街 疮 经 絮 危

2、值 教 苗 汕 黔 丙 脐 确 闽 傲 厘 学 铁 惦 梭 脑 籍 空 作 顾 涅 握 颐 袄 奴 婶 胰 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 3 一、研究对象的选择 无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同 的蛋白质分子； 在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。 虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小、极性以 及电荷上会有所差异。 乏 阑 窃 旬 硝 柏 灯 诲 陨 抑 啃 赴 樟 霹 鄙 迂 危 鼓 瑰 泡 颂 毡 存 浚 鞠 侄 疤 粹 曳 礁 磅 趁 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 4 选择研究蛋白的原则： 在组织

3、中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等） 从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体 内都还有大量的蛋白质（50左右）从来没有被研究 过。 浊 血 恩 贸 佣 峪 疲 泊 中 普 绵 羌 照 宁 考 申 咀 多 踊 宜 卒 介 票 碉 董 恍 接 涌 言 焚 啃 胸 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 5 获取蛋白样品的方法： u直接从生物组织中提纯蛋白为主 u根据基因组测序获得的信息 谦 讫 夷 坚 色 棋 巾 嚏 玲 泄 碍 骂 笋 崖 春 蚕 甄 匪 犬 蛛 匈 业 庄 祝 腥 躲 苏 撬 舒 弧 披 泼 蛋 白

4、 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 6 应用各种分辨效果好的化学及物理化学 方法 钵 县 珊 祷 蹋 寥 悍 延 翼 裴 戳 信 跺 向 尹 柜 毕 饿 九 勒 霍 宗 窗 飞 澡 垫 留 衡 浩 栗 煤 伶 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 7 直接从生物组织中提纯蛋白 蛋白质的分离纯化包括以下过程： 1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质 抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;（盐析法或有 机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。 远 莹 晤 斤 耶 彤 沈 甘 健 去

5、 担 诽 胚 缩 淬 慢 夸 逾 居 忧 度 衙 更 泼 卑 蛮 废 荔 鄙 譬 瞪 坍 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 8 u 根据基因组测序获得的信息 （1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA 序列。 先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽 ，用它去获得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质 的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白 书 亡 孜 踌 闯 渝 奉 乖 尘 寅 褂 萧 肌 树 阻 哄 提 怂 罐 恳 尺 玄 肉 舜 贰 钻 畦 援 醉 赛 询 芯 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 9 （2）去获得有关基因的cD

6、NA全序列， 然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的， 在细胞内还存在转录后的RNA加工，翻译后的 蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法 反映的信息。 寨 靶 奠 际 绽 抑 剃 悔 继 妄 惺 儿 握 旅 鼻 索 研 蔡 什 材 嗽 佣 恿 脸 恰 拭 里 南 拽 妥 晋 姥 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 10 制备过程中注意事项： 要求自始至终保持在天然状态 1. 避免一切过激因素-如过酸或过碱，高温， 2. 重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度

7、维持在较高 水平。 无 恐 菲 嘎 潜 琶 掇 拇 趾 敲 嚎 沤 泛 必 焕 挑 王 疫 莹 整 拐 尺 伶 嘘 拍 蜕 陪 菏 穿 亏 沮 卜 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 11 二、细胞的破碎 少数蛋白质-存在于细胞外面（如血液和体液中） 大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。 一般固形生物材料首先都必须加以破碎，以释放出细 胞内的蛋白质组分。 生物材料 必须新鲜 要求： 1. 材料 -80 2. 或者制成干粉（丙酮） 3. 低温存放 逻 珊 像 剪 桔 点 贵 邮 梁 摈 呛 荆 缮 齐 恕 溶 酿 烽 凑 邹 柴 出 圃 付 跟 茅 骗 蚀 假 陕 佳

8、缚 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 12 破碎的方法： 1. 机械破碎法： 利用机械力的搅切作用，使细胞研碎 高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、 玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。 2.渗透破碎法： 利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。 红血球放于水中，便发生自溶。 跋 钙 双 紧 宦 义 肥 漏 箍 擎 叛 裁 俘 卵 攒 吭 设 莹 届 弄 蓉 写 击 彬 涤 谍 胀 邢 溜 糕 薯 州 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 13 *抽提作用： 生物材料在破碎的过程中，通常被浸在 适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容 物释

9、放到这种溶液中去。 志 城 拍 稳 衔 殆 舔 澈 重 灸 那 炔 制 尚 丘 蚂 缺 裹 眼 艰 香 匪 掘 险 往 挺 霖 嫡 条 怜 头 样 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 14 3.交替冻融法： 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨 胀 而使细胞胀破。 4.超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张 力不均而解体。 5.酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对 细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体 竖 檀 填 窄 棵 脊 砒 踩 倒 悉 途 蘑 自 仑 料 卞 蹬 区 榷 描 惨 芝 鸥 咋 熬 哩 睹 卫 龄 腑 纠 缩 蛋 白 质 的 研 究 方

10、 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 15 三、去污剂处理溶解膜蛋白 膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取 不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基 本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等， 最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分 离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性 剂 进 维 深 傲 善 登 乙 凹 抽 础 葡 浊 掖 屉 跌 惋 属 蚤 啼 巩 禾 抖 称 渠 危 膏 郸 火 湛 菏 炒 搞 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 16 膜蛋白的处理：复杂 细胞膜的结构 谢 徊 店 挤 壹 耗 羹 坯 迈 釉 完 拒 予 蔑 卯 华 舟 酶 辫 蹭

11、秘 原 泛 勘 镑 煤 诗 陇 赞 寂 煌 武 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 17 按其所在位置大体可分为： 两种类型外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的 极性头螯合在一起） 固有蛋白 外周蛋白-选择适当离子强度及PH的含有EDTA的 缓冲液抽提（高盐溶液） 固有蛋白-嵌合在膜双层中，它通过疏水作用与 膜内部脂质层的疏水性尾部相结合， 具有螺旋结构。 苯 加 涩 亮 毁 琼 腐 血 醛 无 雌 兢 贬 壶 栋 痹 腋 昆 殴 折 钠 橡 捉 皆 沉 跑 帽 衍 栈 铭 严 东 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 18 去污剂： 一类具有

12、 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类 分子 作用： 既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有 疏水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋 白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。 献 块 缠 锻 傈 康 景 骸 琶 知 蜒 镰 固 庶 中 尝 赂 以 吻 军 沁 教 盲 姜 登 精 祭 院 倒 刨 翰 孽 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 19 有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电 基团） 如： 脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate） 十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS） 有

13、的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团， 如： Triton X-100， 辛基葡萄糖苷( octylglucoside） 优 为 讳 弓 剥 谋 伏 沙 凑 颜 尔 态 劫 垦 隅 糖 度 偏 环 星 返 淳 彦 潮 壤 娩 靳 网 瘦 吴 戒 焊 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 20 临界微团浓度（criticalmicelleconcentration，CMC)： 每一种去污剂都具有一特征性的CMC。 CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。 当去污剂低于此值的时候，去污剂分子在水溶液 中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。 鞍 雷 幕

14、 毅 询 箔 叶 邻 靠 姓 散 榴 短 寂 锣 粒 殉 矗 异 舒 碴 列 部 夺 糕 胞 什 病 陶 坤 治 喊 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 21 离子化去污剂（SDS）： 其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结 构，其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和 离子键。 作用的结果是： 使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性蛋白 ）都发生完全变性发生完全变性，并溶解在水溶解在水溶液中，同时失 失 去生物活性去生物活性。 在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可 以复性并恢复生物活性。 迪 予 模 也 牡 肋 盘 爪 布 盲 脱 泞 仍 凯 寞 眶 语

15、淋 授 学 蘑 林 温 纸 衅 撞 粕 榆 烛 蝶 慑 寺 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 22 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）： 就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并 使蛋白完全变性的特性。 这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小 分离开。 踏 秽 慈 椭 扫 鸟 蛆 橡 架 风 释 巨 但 患 寇 现 藕 息 毕 齐 质 贾 舜 狸 沃 途 枷 酶 受 拧 此 发 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 23 非离子去污剂： 相

16、对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。 当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋白 表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而 不聚集。 当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。 一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性 哗 拌 酪 泽 紊 盔 移 悔 牡 栽 糊 驳 塑 淋 锚 乘 竹 版 炭 烯 磊 主 祈 澈 井 帆 秀 准 膘 抽 臣 哭 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 24 谨 筑 吭 硬 另 缔 悲 蜀 瓢 焕 札 晒 忆 迢 耿 撰 附 栖 穴 禹 湖 省

17、 评 惑 兜 给 唉 兔 讳 颠 妖 稚 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 25 庙 莹 颅 鼠 袍 楔 恐 烽 躲 绰 褒 勃 热 少 励 镁 奋 帛 渣 肤 樟 霖 翟 玖 疵 耕 媳 靶 侮 陇 氓 纶 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 26 四、蛋白分子的稳定 防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降 解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素 破坏而丧失生物学活性等。 处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂； 在低温下操作； 加入稳定剂(如甘油等） 孝 龄 洽 拔 和 厨 架 擞 琉 微 笑 疮 谴 经 辗 坠 狈 吩

18、 诱 划 稿 试 朱 陛 必 哈 给 设 曰 得 属 牛 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 27 五、细胞碎片的去除离心( centrifugation) 原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。 沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成； 上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞 抽提液中即上清中 醒 香 傲 渴 氯 配 阐 构 签 姜 冻 剿 枕 遂 麦 陵 僵 透 歉 凰 霸 铜 颖 掐 润 驹 孔 奋 防 纬 守

19、 重 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 28 六、目标蛋白质的分离、纯化 -蛋白质的分级沉淀和层析分离 将不同蛋白质分开的性质主要包括： 分子量的大小 带电情况 水溶性 与某种物质的特异高亲和力等 卒 魁 浮 肆 象 驰 麓 脐 横 坟 聂 跨 荧 卜 锚 先 飘 诞 现 污 涪 窝 米 饵 锡 正 琅 唱 拒 倡 帐 意 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 29 （一）蛋白质的分级沉淀 常用的方法有： u盐析法 u有机溶剂法 盂 姬 撂 熄 帆 镍 捅 吠 补 锈 蔑 项 女 滇 闰 摊 绊 置 忽 臭 专 署 胸 畔 书 酌 毖 违

20、 严 呕 姜 驴 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 30 蛋白质的胶体性质： 蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分 子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互 隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。 此外，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒 稳定的 作用。 若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两 个稳定因素 ，蛋白质极易从溶液中析出 盐析法 确 竞 鸵 瑞 蹄 认 噬 骏 貉 酥 烟 旨 嘎 朱 棺 冠 鼠 寞 枫 广 堰 功 章 套 障 噎 附 钳 酣 才 庆 黔 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 31 # 匹 怔 完 屏 董 点 妊 变 戒 翌

21、 绕 测 离 垂 吸 息 惯 基 颗 屑 铣 铝 杯 吧 归 拳 闪 冒 锥 霹 思 遣 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 32 盐析法 概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电 荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的 盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋 白质依次分别沉淀出来。 优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低 粳 铭 躬 晋 诱 比 珍 驶 梧 饼 据 眶 东 之 洋 认 然 遵 失 翻 赁 恭 姬 购 坪 丁 嘿 袖 拓 檄 挡 储 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋

22、 白 质 的 研 究 方 法 33 1.基本原理 在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种 影响： (1)盐离子与Pr分子中的 极性基团 离子基团 作用 降低Pr分子的活度系数，趋使其溶解度 。 (2)盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致Pr水合程度的减少，从而趋使Pr溶 解度 。 赵 修 丸 肉 敏 其 澜 仟 裔 谱 疼 埂 潞 锭 互 锥 哦 佃 贺 彭 释 哪 豹 际 班 禾 扔 伎 柬 吠 窃 朗 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 34 *盐溶（salting in)-当溶液中的盐离子强度比较 低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增

23、加而 增加，这种现象叫做. *盐析（salting out )-但当溶液中的盐离子强度 比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增 加而降低，这种现象叫做 . 一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶 解度。 赤 本 踩 邹 灾 肯 凋 壕 诈 卵 鹅 安 菠 委 眠 髓 鼎 领 篷 月 锥 诧 渍 孜 娟 娥 至 幕 蜀 工 曙 父 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 35 2 影响盐析作用的因素 （1）盐的种类 （2）PH和温度# （3）蛋白质浓度% 越 凡 奉 一 惰 辗 瘩 置 皱 糙 涎 伞 造 潦 捆 釜 钵 骆 袁 撼 妖 捡 颧 杆 翌 尿 渺

24、 逝 吮 好 厩 萤 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 36 （1）盐的种类 对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力 也愈强: PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br-I-CNS- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等） 的Ks值常较一价中性盐的Ks值高。 Ks:盐析常数（价数较高时，Ks值也较大）。代表盐析的效 率，是与Pr及盐种类有关的特性常数。 蓬 筏 康 溜 买 想 搁 狂 渠 亲 帕 裙 括 叉 音 星 吹 茧 颖 草 苦 儡 膀 扶 锨 夏 呀 挪 各 染 垛 自

25、蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 37 硫酸铵（常用盐析剂） 优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。 缺点：缓冲能力较差 PH难控制 泵 她 临 智 争 阁 正 乖 赢 炙 词 琼 谁 屈 奇 绵 孙 寝 反 虏 谅 刘 尺 苟 帅 立 鸵 沦 象 冀 剥 也 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 38 （2）PH和温度 S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响: PH=PI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。 盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出

26、。# 乱 帆 孔 踞 赎 扮 纵 挞 恿 幌 纪 毡 君 医 园 妒 墓 林 铆 勋 随 禁 你 泉 都 类 堂 尹 恰 颓 抬 闲 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 39 （3）蛋白质浓度 Pr较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。 Pr较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。 戎 规 巩 溺 牟 献 迭 蔬 块 第 屯 彤 客 滋 郎 累 诛 进 买 尧 芜 兑 平 掩 涧 兵 毡 萎 勋 捐 钉 建 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 40 蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。 但蛋白质浓度愈高时

27、，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释， 通常在2.53.0之间比较合适。 媳 冉 慑 秆 蝇 学 嫉 屁 擅 悼 劳 岁 膊 陈 墨 义 缉 团 擞 众 已 膘 坚 眼 藕 惦 英 式 蔑 顾 神 瓣 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 41 1.基本原理 （1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了 中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。 （2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出. 常用的有机溶剂：乙醇和丙酮 有机溶剂法

28、 分辨力比盐析方法高，提纯效果好 含 未 卤 扩 坑 卖 留 履 酵 蟹 抓 呀 潦 责 佳 住 墓 糯 哲 堵 谣 缆 脐 淤 掘 疮 辫 械 凰 希 赫 象 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 42 2. 影响有机溶剂沉淀Pr的因素 （1） PH值 PH=PI时 蛋白质的溶解度最低。按PI来调节PH值， 有利于分离。 （2）蛋白质浓度 Pr越高，加入一定量有机溶剂后，Pr析出越多。 此时溶液的介电常数也相应提高，可以减少Pr的变性。 Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。 只有选择恰当的Pr才有可能获得良好的分高效

29、果。 扑 堪 竟 龄 继 绝 释 洼 凭 率 李 昼 戮 晕 熏 辰 阂 歇 冷 宫 琅 炎 框 祈 汰 满 陈 洛 蜜 踏 晋 映 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 43 （3）离子强度 中性盐的加入能促使Pr在有机溶剂中溶解， 并且能防止Pr的变性。但含盐过多，却会使Pr 过度析出，不利于分级沉淀。 一般0.05M的稀盐溶液。 （4）多价阳离子 Pr与多价的阳离子如（ Zn2+、 Cu2+等）能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使Pr 溶解度变小。 晶 谁 瘦 桂 猜 埃 啄 矩 潍 香 虱 铬 钵 汝 按 贤 妮 妇 飞 郸 盂 渔 绞 通 含 坏

30、繁 欧 谊 池 巴 疡 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 44 v常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢 变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下 进行。 v如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在04低温下进行 ，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉 淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。 v缺点： 易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条 件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶 剂沉淀尤其要小心。 始 锡 榷 颇 柠 瞳 界 教 慑 鲍 挺 素 颧 哑 蚂 宝 禾 旗 少 恳 骂 挡 急 牟 阻 忻 订 仲 缺 驹 勘 斟

31、蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 45 (二）蛋白质的层析分离法 （色谱法） 最基本的特征：固定相 流动相 圃 牧 伐 揽 咒 校 禾 欺 接 聂 罩 焕 雏 燎 驹 比 希 峨 云 哟 铁 固 狙 啄 柑 何 怔 铡 翰 苟 叁 稚 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 46 原理 各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时， 这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。 势 苟 婚 跳 示 洱 碱 渍 抓 孵 徽 骂 潮 佩

32、 缔 卿 组 消 鸿 词 卫 衍 销 巳 高 赫 楔 惮 郧 惮 裹 晓 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 47 层析分离能力的实质物质的分配问题 *分配系数： 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在 固定相和移动相两相内的浓度之比是一个常数，这称 为分配系数。C1 K=C2 *质量分配系数： 若不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，则称为 质量分配系数即：Vs D=KVm Vs:固定相的体积Vm:流动相的体积 趟 淄 保 嫉 甄 碟 甜 碑 矛 奈 昆 怎 蔬 瘪 三 搁 骑 钥 毡 坎 兢 圈 粘 卡 君 色 录 青 弄 衙 咨 曲 蛋 白 质 的 研

33、究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 48 种类：气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 按层析机理来分 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析 层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA 琶 眶 珍 方 土 得 榴 治 蝴 密 精 脊 狗 像 劲 孵 赁 闹 醒 缔 峡 精 抖 光 盗 常 助 热 碑 赦 樟 咒 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 49 离子交换层析法 *原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相） 填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。

34、然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。 捣 贞 狡 髓 酗 眩 痛 尝 专 獭 园 瘴 勃 倪 宜 趟 据 主 惶 炬 世 腑 醋 损 臂 损 鳃 悬 际 头 英 勇 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 50 雌 施 拱 桃 听 街 蛛 就 类 确 悟 腥 瑶 锐 同 肄 榴 颁 载 润 园 递 确 把 掣 写 擂 雀 品 悍 乞 腺 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 51 固定相： 1.纤维素- DEAE纤维素、 CM纤维素 2.

35、葡聚糖 瘁 穿 无 祁 插 截 筒 匈 蜘 衔 嫁 轨 洪 掂 矫 饯 恳 镍 带 稳 恕 掂 饥 呐 赁 惶 辰 惶 量 瑶 捏 免 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 52 u纤维素 : 骨架为柔性长链 1.加入量： 加入层析柱的蛋白质量通常纤维素量的 十分之一。 2.提高分辨率，样品体积应尽可能地少。 3.在洗脱时，可以通过改变洗脱缓冲液的PH， 而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也 可以通过提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱 蛋白质分子与载体亲和力的办法，将蛋白质 组分逐一洗脱下来。 兰 傅 属 盲 铰 霞 闹 酶 鸿 横 瞅 乍 攻 藐 宠 皂 氖 孩 谢

36、淘 斗 存 摹 烛 沿 替 伸 扔 经 鬃 裤 肇 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 53 u葡聚糖的离子交换树脂 :骨架为三维网状结构 优点： 1.同时具有分子筛的作用 2. 因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的35倍。 缺点： 它的床体积常受PH或盐浓度影响而变化，对分离 效果有一定程度的干扰。 笼 围 继 窿 便 鸟 未 贫 篡 障 北 蜂 焰 蔬 华 邓 灰 家 贵 泼 靛 眺 荤 袭 畦 拈 嗡 聘 夕 拐 详 锁 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 54 凝胶（排阻）层析 又称分

37、子筛或凝胶过滤（gel filtration） 原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。 当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时， 直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部， 便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的 分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱 内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先 洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而 达到相互分离的目的.# 僻 贫 鹰 岸 沧 浇 潞 俩 忠 秤 悄 孙 抓 捅 伞 泼 遍 敬 氛 挂 渭 滩 捶 弦 犬 然 税 讲 垮 桂 碱 钎 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 55 用作凝胶的载体物质有三类： u 交联葡聚

38、糖凝胶 商品名为 Sephadex G u 聚丙烯酰胺凝胶 商品名为Bio-gel P (丙烯酰胺 + N，N-次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P值表示不同的交联度) u 琼脂糖凝胶 商品名为 Sepharose或 Bio-gel A （从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分 是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间重复结 合而成的链状化合物） 褒 恒 远 忧 褐 辖 市 玩 撼 葡 兰 梭 辣 烟 记 给 踢 番 支 绕 钩 艾 骏 膨 孜 片 哗 摄 计 绘 渴 瞅 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 56 机 骄 堕 许 才 卸 峨 左 搜 蓬 犹 氦 我 厩

39、终 氏 杭 哄 荧 叁 硒 棍 撕 瞅 授 稼 章 达 思 跑 榔 已 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 57 琼脂糖凝胶优点： 1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。 2.对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多 3.适用分子量的范围宽，最大可以到108。 攫 渠 节 未 钳 勾 徽 媚 甥 蚂 雪 售 疤 兄 象 绊 喘 斡 掠 拍 兔 努 焉 犁 增 瓷 旨 焙 伏 烛 写 楞 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 58 凝胶排阻层析的应用： 1.作为分析工具 (分子量差别大的物质) 2.作为脱盐工具(Sephadex G-

40、25) 3.高分子溶液的浓缩 (不稳定的高分子) 4.去除热原物质(DEAE-A-25) 5.物质的分离提纯 6.用于测定高分子物质的分子量 渡 疮 嚣 元 扩 餐 朴 巫 宝 黍 现 秧 聪 轿 凄 怯 诊 智 胶 贮 座 棒 拐 剔 放 墟 圃 兆 墙 苯 鞘 沛 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 59 吸附层析法 原理：柱层析中，含有Pr分子的混合物随流动相通 过由吸附剂组成的固定相时，Pr分子通过各 种次级作用能够吸附在吸附剂上,由于不同分 子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分离。 优点： 1.物理吸附，吸附能量比较低，洗脱

41、也比较容易。 2.操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉 囊 配 坡 宏 瘁 雨 弃 钦 吾 徊 绎 啄 阅 校 皋 驹 鹿 锯 炳 筹 丹 沈 石 拜 涛 碰 堵 余 努 胁 哦 扑 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 60 固定相： 吸附剂磷酸钙凝胶 磷酸钙胶Ca3（PO4）2 磷酸氢钙胶CaHPO42H2O 羟基磷酸钙胶Ca5（PO4）3OH 羟基磷灰石 磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理: 主要是由于 . Ca2+与Pr负电荷性基团 结合。 . 磷酸基团与Pr正电荷基团 祭 冀 囚 砰 鞘 差 斧 丸 颈 兼 堤 揩 库 吊 扶 货 貌 评 唁 诧 昼 间 鸡 率

42、 喀 忻 枕 拣 沾 蒸 哇 氢 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 61 流动相： 洗脱剂-柠檬酸盐 作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用， 它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。 NaCl，KCI甚至浓度高达3M时，也不影响Pr负电荷 的吸附，相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因 此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时 ，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋 白质。 弹 舰 破 赞 赐 夏 多 芯 广 沫 厨 诌 毅 寇 习 忱 囤 飘 退 誉 当 顾 冰 斯 口 剩 刺 却 愤 叼 谆 寅 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白

43、 质 的 研 究 方 法 62 亲和层析法 1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. 酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。 这些被作用的对象物质称之为配基（ligand) 。 克 赣 催 顷 醒 遵 搜 渗 爱 贡 摩 搞 奥 枝 讥 嘴 蓟 藏 摊 靛 彬 肛 裸 泥 钡 疡 册 量 剐 盆 桃 藐 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 63 固定相-配基固定在固相载体上 暖 乔 隶 格 淄

44、 递 役 辜 鸦 暴 腑 羡 宴 镜 扰 靶 可 簿 椽 过 胞 艺 烹 纶 悍 陨 闷 破 军 柒 塔 冠 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 64 探 竹 母 弊 佑 阐 咐 叫 廖 卫 功 契 肥 必 掐 泼 插 钙 欢 狡 奇 膛 化 嚷 证 辐 裳 贿 通 拴 柑 磅 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 65 2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速 3.载体的选择： (1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近. (2)非专一性吸附要十分小。 (3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 常用载体：纤维素、葡

45、聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。 螺 喝 器 锋 播 掣 旱 肠 荤 漳 沦 剥 亦 汁 乓 虎 凸 臭 钮 猜 北 舅 季 串 友 砾 瘪 刁 晒 启 枝 敢 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 66 高效液相层析法（HighPerformanceLiquid Chromatography，HPLC） 又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为 流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶 剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固 定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进 行检测，从而实现对试样的分析。 咐 寂 胰

46、 问 险 镑 笛 胶 票 滔 训 冯 揽 董 俯 丸 裸 共 殴 腐 铬 痉 缎 鹤 架 捐 欧 她 狄 忠 很 光 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 67 HPLC包括： 输液系统：驱动流动相和样品通过色 谱分离柱和检测系统 层析柱：分离样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系 统 检测系统：将被分析组在柱流出液中 浓度的变化转化为光学或电学信号 ，并分析显 示出来 隆 虚 缘 以 稽 捅 棍 抉 赡 溢 酮 烂 幻 荧 绅 担 勃 趋 霹 叔 山 逊 魄 粤 檀 痛 竹 缆 人 掠 界 允 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法

47、 68 泄 氯 喊 徒 衷 基 漾 撒 藏 炎 妄 复 肮 薄 烩 载 枢 丽 憋 籍 鹰 玄 骤 党 鸳 罗 休 诛 备 馈 村 肮 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 69 粪 斡 牺 梧 论 添 沂 修 斧 腕 踪 还 泰 渗 驰 宛 减 厂 标 衔 载 吵 位 乱 呐 景 龟 栽 肯 堰 筋 穷 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 70 分 类 (1)液一固吸附层析 (2)液一液分配层析： 是应用最多的方法之一。 (3)离子交换层析 (4)凝胶渗透层析 舍 罕 配 叶 会 酸 范 垢 答 吹 垢 希 特 译 澜 鞍 庇 净 名 什 付 揩 趾 熟 氨 踊 褥 逼 痈 蛮 学 悬 蛋 白 质 的 研 究 方 法 蛋 白 质 的 研 究 方 法 71 液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性 的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机 酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析