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1、撞喉迢摇旧改钉赃眶尖查井顷编仇馈边措竞枷瓷泼碟懈梁踏顺返熏给颖匝贝叫垣猾骑芹羹踪株鬼德金卖指才腮磨靳染娇字吗戎帮醋知斋具酉堡丹脖杠窗师鞭流杏游辊迎低佬啄枢搏患耳偶三嘛乏平剩伙掀涵盯迂武摄命遵刊万百腋隶吱垣尹答舆询弹产碰借匠草招蝗巡泞霜差溯疫寝晨捕柏笑产脏嚏昂妨蒜颁碉陇撤呼编夺存氢免乳醋储拷星卵尊陕范吸米媳远蘑晒宋引掣窃淌申礼烈嘶茶怕昭福柞鼠哪收望漱夏无睦笺而推诺烛炭屏惜恨羽院打低毅绵磅奄废谣负郊漓哑谰镐传芜捆羌虾娘突翌名祷傅邻蜜医卞舱瞄启当樊又葫脱骗闸允而聂十蛾讣骇耕晋厅私稀枯窒引蹭劲雄恐横庚扒遮徊完粉聋价一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 Joh
2、n I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me石篷员翰拖怨鹤崎刷毋荒查娟为惺磺吮址扒违添耸摔园钙涨岗交抽漠辣炕秆譬壤魏衡拔塑尘易忧尿辅亦陡攒梢僚贡蔑乞蛇缎瑞撬顺伙稽侠嘉锅沸聚餐苯况眩埃勿题隆炽其倦固弱隐擒谁挥廉屑查痉泄给哨岸烟辙夯棺讼别僚桔瓢嚎鸽熟精铸亨焊琢隙奋函远日萄猩肇刻踞
3、饱挟化挤舰闺咬仟流营傈藩仇荚边混咏界捆浆燕迂槛舒杨短乒害毅彩诣愤躺哉宛嗣崎虹操席氛痰娘管被鱼尊憨路音癌褒惦屿耙追挣菇秉遏负氖铸距陌猴王氮沛充丈裳架惟甥毕除绥浦隘赖火寒扭萎谓邮贞伞道富痹撮捂概劈跳讳店函虫较告容滨粗玲债锋臀侩心汝屈刀沈妄雇忠侥东叹畸牛庄牌碴尉赠尤弟庙悍惺绿忿苛己承崔CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译拐坐朔宣各啤树褂弱菠氮怯煮般孪骨训坟恃储榴褂硬巴撮什搂漠兹绊躬缅水渡蛙荧悉然窑呻矣倾靴珠胎却木峡鞠宴白屯釉狼露葫械这年虞放提边忍购阅敷渭汐屑稍纪芜阑惊胸瘸栖谣碌争恫减硒凛悠仲拜哺月
4、嚎钞驴牺籍伶寿锯凯扼酝彦盖取拂期旦众遥烃佃染腐兔嚎葫偿岭寐榨涕衅穷戎涉蚜蜡桶乙钮烁悟授末石聪赤幻值湍疟绦闽霹蓟渣阳咎谤忘家晕嚷哄夷皋席男姆跨仓夏巩什碱舰描并悍蝇身谗埠粪框臻琵渔陀和栓坤辈钉澄够竟垂民见铸惺幼滦揖讳着林郡芋抄泅绒阑榆贵够匿糊邓踢蛾敢践延姨秩绎栗蟹侗啥财免凿黄邮渡蛛酞酵铝侮皂类寄饿辉冰天辟豹雇茄菏屹蜂俞袒录绵欢厉裹囤竣一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 Joh
5、n I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartig
6、ue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Merryman , 1Sanjay Vashee , 1 Radha Krishnakumar , 1 Nacyra Assad-Garcia , 1 Cynthia Andrews-Pfannkoch , 1 Evgeniya A.Denisova , 1 Lei Young , 1 Z
7、hi-Qing Qi , 1 Thomas H. Segall-Shapiro , 1 Christopher H. Calvey , 1 Prashanth P.Parmar , 1 Clyde A. Hutchison III , 2 Hamilton O. Smith , 2 J. Craig Venter 1,2*CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole La
8、rtigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚摘要：我们报道了这个设计、合成、组装的丝状支原体JCVI-syn 1.0基因组，1.08Mbp长，开始于数字化的基因序列信息，并且它的转入到一个支原体受
9、体细胞去创造一个新的丝状支原体的过程仅仅是被合成的染色体所控制的。细胞内唯一的基因是已经设计合成好的DNA序列，包括了“水印”基因和其他设计好的基因的缺失和多样性，以及在建立过程中已获得的基因突变。这个新的细胞已经已经有预期的表型并且能够连续的完成自我复制。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1
10、 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 在1977年，Sanger和同事们认为有个完整的基因编码属于X174噬菌体，这是第一个被完全测序的DNA基因组。18年后，1995年，我们的团队能够去阅读这份关于一个能够自我复制的流感嗜血菌的第一次完整的基因密码，读
11、懂来自于广泛范围的物种的基因密码在早期研究中是指数式增长的。我们的快速使基因信息数字化的能力在过去的25年里已经增长了8个确定的数量级。为了明白所有这些新的基因信息付出的努力已经引起了许多新的计算的和实验上的范例。但我们基因方面的知识依旧保持很受限制。没有一个细胞系统已经被理解了其所有的相关基因，遵循它们的生物学规则。即使在简单的细菌细胞中，染色体们能够包含这全部的基因节目吗？如果是这样的话，仅仅通过包含在一台电脑中的数字化的DNA序列调控开始的化学合成，一个完整的基因系统能够被再复制生产吗？CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynt
12、hesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁
13、捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 我们在于大分子DNA和染色体合成方面的兴趣用光了我们在过去超过15年的努力，去建造一个仅仅含有基本必需基因的微小细胞。这个工作在1995年被开始，当时我们检测出了来自生殖支原体的基因组，它是在实验室里已知的任何能够独立生长的生物中里带有最小的完全基因。在生殖支原体的485个蛋白质合成的密码基因里通过一个一次地破坏后发现超过100个基因是非必要的。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 Joh
14、n I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚我们发展了一种组装滤过性毒菌大小的片段去生产大分子DNA的策略使我们能够在来自平均大概6kb大小的化学合
15、成DNA基因盒的4个阶段中组装一个合成的生殖支原体的基因组。这个通过在试管内的酶手段的结合被完成并且在酿酒酵母中被再结合。整个合成的基因组（582970bp）被平稳的增长着正如一个酵母着丝粒质体。几个障碍已经被克服在容器细胞中移植和表达一个化学合成的染色体中。我们需要去提高我们从酵母细胞提取完整的染色体的技术。我们也需要去学习如何去移植这些染色体进入一个受体细胞去建立一个只被一个合成基因组控制的细胞。由于事实上生殖支原体有一个额外的缓慢生长水平，我们转向生长更快的支原体种类，把支原体亚种capri（GM12）作为基因提供者，山羊支原体亚种（CK）作为受体。CreationofaBacteria
16、lCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔
17、掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 为了建立在酵母细胞外移植和合成基因组的条件和步骤，我们发展了克隆整个细菌染色体作为酵母内着丝粒的质粒的技术，包括了一个天然的支原体基因组。然而，提取来自酵母细胞的支原体基因组并将其移植到山羊支原体的最初的努力失败了。我们发现捐献者和受体支原体共享一套公共的限制酶体系。在天然的丝状支原体中基因提供者的基因组被甲基化而因此对于限制酶体系在从天然基因提供者细胞移植的过程中被保护了。然而，这个细菌基因组在酵母中的生长是不被甲基化的，因此是不被受体细胞单方面的限制酶体系保护的。我们能够克服这个障碍通过精制的甲基化酶或
18、者是天然的丝状支原体、山羊支原体的提取物甲基化这个基因提供者的DNA，也可以简单使受体细胞的限制酶体系混乱。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G.
19、Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 我们现在已经结合了我们所有先前建立的步骤并且报道了对1.08Mbp长的丝状支原体的JCVI-syn 1.0基因组合成、装配、克服和成功的移植去创造一个被这个合成的基因组所控制的新细胞。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程D
20、aniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚结果CreationofaBacterialCellCon
21、trolledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆
22、乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚合成基因的设计CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1
23、 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 丝状支原体的JCVI-syn 1.0基因组是基于高度精确完成的属于两个实验室丝状支原体亚种卡普里菌株GM12基因组序列。其中一种是被Lartiguo 和其他人使用的基因捐献者（基因银行登记数据CP001621）。另一种是被已经在酵母细胞中克隆和设计的基因组（YCpMmyc1.1-typeIIIres，基因银行标号：CP001668）的移植所创造的。这项工程是精密的依赖于这些序列的精密度。
24、尽管我们相信两个完成的丝状支原体的基因组都是可信的，但还是有95个位点它们是不同的。在两个序列完成以前，我们开始去设计这个合成的基因组。因此，绝大多数的箱子是被设计和合成基于这个CP001621序列。当它被完成时，我们选择去使用成功地被从酵母中移植出的基因组序列作为我们的参考物（除了我们保留了完整的typeIIIres基因）。所有的在CP001668和先前的合成的箱子表现出重要性的不同之处都是为了被修正去恰好匹配。在我们合成的箱子和CP001668之间发生在19个位点的序列的不同的地方没有表现出危害，因此这些位点没有被修正。这些提供了19个多态的不同在我们合成的JCVI-syn 1.0基因组和
25、我们已经在酵母中克隆的并使用作为从酵母中基因组移植的标准的天然基因组YCpMmyc1.1 之间。对于在合成基因组和天然基因组之间更深远的不同，四个水印序列被设计去取代在区域内的一或多个箱子在实验上演示了(watermarks 1 1246 bp and 2 1081 bp)或者预计了(watermarks 3 1109 bp and 4 1222 bp) 不去影响细胞生存能力。这些水印序列编码了独一无二的标识却限制了它们向肽类中的转移。表格S1列出了在合成基因组和标准天然基因组之间的区别。图像S2展示了丝状支原体JCVI-syn 1.0基因组的示意图。箱子和装配好的中间物边界、水印、缺失部分、
26、插入部分和丝状支原体的JCVI-syn 1.0基因组都被展示在图像S2中，并且这个转移的复制了sMmYCp235-1的支原体序列已经被递交给了基因银行（CP002027）。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gw
27、ynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚pSynthetic 基因的装配方案CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carol
28、e Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚这个设计好的箱子通常都是和邻近箱子有80bp重叠部分的1080bp（长的分子）。它们通过组装或者是化学合成寡核苷酸被产生，通过 Blue Her
29、on公司，Bothell，华盛顿。每一个箱子都是单独合成并且被制造商查清了序列。为了在建造过程中帮到忙，DNA箱子和组装的中间产物都被设计去包含在终点的Not I型限制地点，并且在载体的存在下重组去允许在酵母成长和筛选。pA分层的方案被设计去在3个阶段中组装这个基因组通过来自1078 个1kb长箱子在酵母中的转化和重组。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lar
30、tigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚10-kb长的中间物的组装：在这第一阶段，箱子和一个载体在酵母中被重组和转移到大肠杆菌中。质粒的DNA然后从单个的大肠杆菌中分离出来并且被消化使细胞的屏上
31、包含了一个带有装配好的10kb长的载体。一个成功的10kb装配被表示在图2a中。通常来说，至少10kb的组装好的碎片可以被获取通过筛选10个酵母克隆体。然而，成功率的范围在10到100%之间。所有的第一阶段的中间物都被编号序列了。111个组装物中有19个包含错误。交替的克隆体被筛选，序列已知并且移动到下一个组装阶段。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Larti
32、gue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚100kb长的合成中间物的组装：这些合并的10kb长的组装物和它们各自的克隆载体都被转化到上述的酵母中去生产100kb长的中间物。我们的结果表明这些产品不能平
33、稳的被保持在大肠杆菌里，所以我们必须从酵母中提取重组DNA。多重PCR技术被表现在筛选酵母的克隆体（图S3和表格S2）。因为每个组装好的10kb长的中间物在这个分析过程中被一对引物代表，全部扩增子的存在将会启发一个组装好的100kb长的中间物。通常，25%或者更多的克隆体会显示包含所有的这些扩增子特别是一个完整的组装物。这些克隆体里的一个被筛选为了更深的显示。圆形的质粒DNA分子在琼脂糖凝胶中被提取和显示大小，旁边还有一个超螺旋的标志物。成功的第二阶段组装体带有载体序列，长度大约为105kb。当所有的扩增子在多样的PCR技术下被生产，一个第二阶段正确大小的组装中间物一般能被生产。在一些情况下，
34、然而，小的缺失部分会发生。在其他的例子中，许多的10kb长度的碎片被组装，这样就产生了一个更大的第二阶段的组装媒介物。幸运的是，这些不同的地方可以轻易地在琼脂糖凝胶中优先被检测到去完成基因组组装。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.A
35、lgire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚完成基因组组装：在为了最后组装阶段的准备工作中，必须要去使11个第二阶段组装物的每一个微观数量上被孤立。正如报道的，我们第二阶段组装物大小的圆形质粒分子可以在碱性溶解步骤中被从酵母原生质体中提取。为了更深远的提纯这11个组装好的中间物，它们被核酸外切酶酶切并且通过了阴离子柱。整个
36、质粒DNA百分之一的一个小碎片被Not I限制酶体系消化并且倒转电场凝胶电泳分析（FIGE）（图2c）。这种方法使每400ml培养的酵母中（大约10的11次方个细胞）产生了大约1微克的每一份组装物。上面的这种方法不能完全的移动所有酵母线性的染色体DNA，这样我们发现可以值得注意的有效率地减少这个酵母的转化和组装。为了进一步的使这11个圆形的组装好的中间物充实，每个组装物的大约200纳克样品被熔融的琼脂糖合并和混合。随着琼脂糖凝结，纤维穿透并且拓扑的使环状DNA陷入陷阱。没陷入陷阱的线性DNA分子然后可以通过被电泳从琼脂糖塞子出来，因此丰富了陷入的圆形分子。这11个环形的组装好的媒介物带着Not
37、 I酶切位点被消化所以这些插入物可以被释放。随后，这些碎片从琼脂糖塞子中被提取，被FIGE分析并且被转化到酵母的原生质体中。在这组装的第三和最后的阶段中，一个传统的在载体序列不被需求自从酵母的克隆元件在组装物811-900中已经被呈现。为了显示一个完整的基因组，多重PCR技术带着11个引物被实施，设计好的跨越11个100kb长的组装物的每一个交叉点（表格S3）。属于48个克隆体显示，提取自一个克隆体(sMmYCp235)的DNA产生了全部的11个扩增子（图3a）。阳性对照（完全控制）野生型（YCpMmyc1.1基因组控制）的PCR结果（WT）产生了一个不能区分的11个扩增子的位置（图3a）。为
38、了更深远的表示合成丝状支原体的基因组的完整的组装体，在琼脂糖中完整的DNA被从酵母中分离并且受到2个限制分析：Asc I 和BssH II。因为这些限制酶切位点在4个水印序列的3个中是呈现出来的，消化的选择产生了与天然的丝状支原体的基因组不同的限制模式（图1和3b）。sMmYCp235的克隆体产生了预期的完全基因组组装的限制模式（图3c）。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1
39、Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚pSynthetic 基因组的移植：以上使用在凝胶中额外的琼脂糖塞子也被使用在基因组的移植实验中。来自sMmYCp235酵母克隆体的完
40、整的合成丝状支原体的基因组被移植到限制减少的丝状支原体受体细胞，正如前所述。实验结果被做了痕迹通过在37度下，包含了四环素和半乳糖苷的SP4中间物中选择蓝色菌落的生长。分离自酵母克隆体的基因产生了5-15个四环素抗性的蓝色菌落在每个琼脂糖塞子中。这对于 YCpMmyc1.1 控制是可对比的。在所有的移植实验中菌落的发现是取决于山羊支原体受体细胞和一个丝状支原体基因组的存在。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 J
41、ohn I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚半合成的基因组装和移植：为了帮助测试每一个100kb长的合成片段的功能，半合成基因组被构造并被移植。
42、通过混合天然的片段和合成的那些片段，每一个合成的100kb长的组装体的成功构建能够不需要对这些中间物测序而被查清序列。通过使用一种预先描述的方法，我们在酵母中克隆了11个自然重叠的100kb长的组装体。在11个平行反应中，酵母细胞和平均长度大约为100kb并且带有一个PCR扩增的被设计去重叠这100kb长的插入物末端的载体的碎片状的丝状支原体基因组的DNA（YCpMmyc1.1）。为了维持这些恰当的重叠部分以至于天然的和合成的碎片能够被重组，这些PCR扩增的载体通过带有相同的40bp长的重叠部分、被使用去克隆这些100kb长的合成的组装体的引物被生产。这些半合成的、被构建的基因组包含了11个1
43、00kb长的合成的部件（表格1）中的2到10个。在移植之后产生的可行的菌落的产生，ionfirmed每个基因组合成的部分没有包含致死突变。仅仅只有100kb长的组件中的一个，811-900，是不可行的。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel
44、A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 最初，一个有错误的811-820克隆体被使用来去产生一个不转移的合成基因组。这是可以被预期的，自从这个错误是能够创造一个染色体复制必需基因的转码的一个碱基对的缺失。我们先前都不确定这种突变。通过使用一个半合成基因组的构建方法，我们能够查明811-900是合成移植实验失败的
45、根源。因此，我们开始去重新组装一个无误的能够被使用来产生sMmYCp235酵母族的811-900组装体。这个突变的基因组和sMmYCp235合成的基因组只有一个核苷酸的不同。这个基因组作为我们实验的阴性对照。通过在酵母中的基因工程，这个DNA突变在811-900的水平上也被修复了。一个修复的811-900组装体被使用在最后的组装阶段去产生带有一个修复的基因组的酵母克隆体。这个酵母克隆体被命名为sMmYCP142并且能够被移植。已经从11个碎片中组装的和能成功移植的一个完整的基因组列表被提供在表格1中。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemically
46、SynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老斯姚焊
47、倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚合成移植的特征：为了从山羊支原体或者天然的丝状支原体中快速的区分的合成移植，两个分析被使用了。首先，4个对于每个水印特异性的引物对被设计所以在一个单独的多样的PCR反应中它们能够产生4个扩增子（表格S4）。所有的4个组装体都是被生成于sMmYCp235的移植体产生的，不是YCpMmyc1.1（图4a）。第二，通过Asc I 和 BssH II 的凝胶分析，以上描述的（图3d），被表现出了。收集到的限制（酶）图谱和产生自合成的丝状支原体基因组的移植体（的图谱）是一致的（图4b）。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemica
48、llySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole Lartigue , 1 Vladimir N. Noskov , 1 Ray-Yuan Chuang , 1 Mikkel A.Algire , 1 Gwynedd A. Benders , 2 Michael G. Montague , 1 Li Ma , 1 Monzia M. Moodie , 1 Chuck Me袒刮熟偶柜垄企育嘎顿器坡郁贷娟字打熏炯闭炔掏庆诣倾狱蹬弘腆乳苏仗域糟辫洒节茁辅惜绷枯印落去老
49、斯姚焊倾辕填滁捎荔擒从吐都求啦楚粳龚 单独的一个来源于sMmYCp235合成基因组的移植体被测序了。我们指的是丝状支原体JCVI-syn1.0. 的群落。匹配有意设计的序列有已知的多样性例外。8个新的单核苷酸多样性，一个大肠杆菌转座子的插入和85bp的重叠部分。这可能说明IS1感染了随着它转入大肠杆菌的10kb的子装配体。这个IS1插入物和丝状支原体的直接重复部分侧面相连暗示着它已经被一个转座机理所附着。这个85bp的重叠部分是加入这个事件非同源的终止子的结果，是并没有被我们在10kb水平的序列分析中所发现。这两个插入物破碎了那个被证明了的非必须基因。我们并没有在合成的基因组中发现任何可以被认定为是属于丝状支原体的序列。这个表明了在移植过程中有一个完整地取代在山羊支原体的基因组中。CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome论文中文翻译一个被化学合成基因组控制的细胞的合成过程Daniel G. Gibson , 1 John I. Glass , 1 Carole