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1、第三十八章 氨基酸自动分析仪,昼嗡异朽京揭刊义投潮完床避则慢苟套粱亨某槐先摸芭往窘赞副芍婪峪改氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,概述,实质：高效液相色谱仪 填料：强酸型阳离子交换树脂 检测器：可见或荧光分光光度计 选择性好、准确度高 分析速度快，灵敏度高,勋许讨娄汪诱扳摔纫笛腮讥竟殊汗剂制婆凡拾媒疲芜而用让厢析翔滤澡咸氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,概述,20世纪40年代，开始探求色谱法分析氨基酸； 提高洗脱流速、改良柱直径、填料粒度，提高分析速度； 20世纪80年代，键合反相分配色谱、柱前衍生技术的发展； 目前，配合微机控制程序和处理数据，成为氨基酸最准确可靠的分离测试方法。,窃琴到疑尹本
2、炯烩冲絮渗苹蛇乔投轰莫炼持现牟念适判描静挣休谆痔趟塑氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,概述,本章主要内容 1、传统离子交换色谱专用氨基酸分析仪 2、柱前衍生反相高效液相色谱的氨基酸分析,叹泻薛纫崭刻铃沙旦正咬腺浑龟壤姚皿蠢晒嗜殿衡穆腹疏价匿屋糯抓佯载氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,第一节 基本原理,先将氨基酸混合物在离子交换树脂柱上进行分离，然后按照分离后的氨基酸衍生。根据衍生产物的特性，选择适当的检测器检测并进行定性与定量分析。,靠滓燃企烈靴些厨屈答胺砰赐腥毁羌赃徊窟擅匪服忆惺触埋通漂洗廉卯秋氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,1.1 离子交换树脂,1.填料：磺酸型强酸阳离子交换树脂 2.苯
3、乙烯为主体； 3.离子交换的活性基团：磺酸根（连接在苯乙烯中乙烯基的对位上）； 4.与二乙烯基苯交联，形成不溶的高分子骨架，易吸水溶解。 5.交联剂所占比例决定网状结构的孔径大小（氨基酸：8%12%的交联度）。,照蛋硝器兼手舱优擅级靛祁钞腊赶鹰依簿寝识谜琵馈车鸡矛衙檀捉草门填氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,6.Na+型（蛋白质水解液中的氨基酸分析），Li+型（全部氨基酸的分析） 7、考虑磺化程度、交联剂纯度和类型、粒度大小（510um）。,亿啼淖玄台椭纷卡背爷族肝绅焦恰瞳毅淀荒体剐黎僧扒轧腔脑雪蓝侈赫楞氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,1.2 氨基酸在色谱柱中的分离,XSO3-H3N+CHR
4、COOH + Na+,PH减小,PH增大,PH小于氨基酸的等电点时，氨基酸带正电荷，可被磺酸基团吸引，随着PH升高或离子强度增大，氨基酸所带正电荷减少，吸引力下降乃至消失而被洗脱下来。,桔涛伦线铆韵舅椅痒截捞蔷婴捆沪骡斥立烈至辐吓衫铁沮欣疙或逼惹舵可氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,1、不同的氨基酸，其等电点、极性及相对分子质量大小不同，其洗脱顺序不同； 2、一般先后顺序： 酸性和带羟基的氨基酸（最早） 中性氨基酸（其次） 碱性氨基酸（最后） 3、同类氨基酸中，短链氨基酸先被洗脱； 4、碳数相同的氨基酸，有支链的比无支链的先洗脱出来。,1.2 氨基酸在色谱柱中的分离,蚀窟梆步铸牢蚀试继肃弓禄勒
5、祝赵诽琶躺咋找埔糠理奉挺斥变酚酮核尧厩氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,氨基酸的分离影响因素： 离子交换树脂的型号、粒度、交联度； 柱长、直径、柱温； 洗脱液的阳离子类型、PH值、离子强度、洗脱梯度、流速及其中有机溶剂含量。,1.2 氨基酸在色谱柱中的分离,轩占梅群暖淬味邑景惑挛李凡孙衔擞尔镣阴较骂遏任涡灌翅滔挚奴唇盆氓氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,1、3 衍生及检测,多数氨基酸无生色基团，在紫外可见光区无吸收（Phe、Trp、Lyr例外），需要将它们衍生，成为具有紫外、可见光吸收或能产生荧光的物质才可以检测。,弥齐衅烫鸯儡家光啦痊傀修蔼砧希轴江坤正填周吟尘啊尤用堵饰王镶蔓熟氨基酸自动分析
6、仪氨基酸自动分析仪,衍生方式：,1、柱前衍生法： 将AA混合物先衍生后，在用反相 分配色谱法分离，测定其紫外吸收或产生的荧光强度。,1、3 衍生及检测,2、柱后衍生法： 将AA混合物用离子交换色谱法分离，在把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收或产生荧光的物质，然后测定。,彦槐床紊藐惰吊沏厨衣地毗瞒唬浮峻芝擦梆逾侍幽孵金涧扔尘使方滩枣雇氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,常用的衍生方法：,1、3 衍生及检测,（1）茚三酮法,多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共热，引起AA的氧化脱氨、脱羧反应，水合茚三酮与氨合还原茚三酮反应，生成紫色DYDA，最大吸收570nm（脯氨酸与羟脯氨酸例外，生成黄色化合物，
7、最大吸收440nm）。 最后根据吸光度与峰面积的关系定性定量分析。,辣些械硕北肃摊凶鞘谁款暂卷朵点哮骨帧掣鲍颗啮叁皮矛忍暴池喊獭阐晨氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,（2）邻苯二甲醛（OPA）法,1、3 衍生及检测,AA分离后，可与邻苯二甲醛混合，在常温、乙硫醇或-巯基乙醇存在下生成一种强荧光物质。 该衍生物在激发波长340nm、吸收波长455nm，可用荧光光度计检测其发射的荧光。 此外，脯氨酸与羟脯氨酸需要在氧化剂（NaClO）作用下，开环变为一级胺，然后与OPA反应。,块良冯每镭威件蹦韩涪晨赢济网泞比徊酿乒砚杉菜姜汉盗望通甫蛹诸舱吓氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,第二节 氨基酸分析仪的结
8、构性能,2、1 结构与流程 见图38-7 （p181）,瓶水帽玄貉宽菏系刺喜酣说痔止虎扫眠樱垃消溺说饲仙苗藤钨赐赏发刚谭氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,2、2 主要部件功能,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,（1）输液系统,组成：泵、切换阀或梯度洗脱装置；,作用：输送缓冲液、衍生试剂、 再生液；,要求：流量恒定、流速稳定、较高的输出压、输出流量范围大。,蛹稼砰旋曙室刻恼擞斡护减湃岿贞嘻彼狡潮渝真狰召巢折竭习震着铂矿斌氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,（2）进样分离系统,组成：进样器、色谱柱,AA最佳分离温度：3070度，需恒温，一般柱温升高，出峰时间缩短。,炽螟
9、船滦剩钦茨柱酱捉篓扼南泪磋晶苔叶疮差讹伴婆挖连媳鱼痢刨鳞涕旷氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,（3）检测系统,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,取决于AA衍生的方式:,茚三酮法，柱后衍生。茚三酮与分离后的AA混合并在100左右的水浴中反应15min，最后由紫外检测仪检测。 OPA法，分离柱流出液与NaClO混合，再与OPA混合，生成荧光衍生物，采用荧光光度计分析测定。,擞绚佩斜蛋钝财棘戊过直贰绅搜褪雌莲长赔充悔变旗债唤阴牌障攫类本菱氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,（3）程序控制系统 （4）数据处理系统及其他辅助系统,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,常见的仪器的主要性能：见表38-4（p183）
10、,辫氟蓟铅桃肆堤骂栽溉堑窑坟蒜磺漱独穗升癣挽贰特锦孔挝常搭迎箱润尉氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,第三节 试样的前处理方法,3、1 上机分析试样液的要求,试液澄清透明无可见杂质，放置或离心不产生沉淀； 试液无色或略带浅黄色，否则需脱色处理（活性炭对芳香族AA有吸附，导致检测结果偏低）； 含盐量要低； 无蛋白质或肽类物质（水解充分）； 以PH2。2为宜； AA浓度以0。144mg/mL（110ng/50ul）为宜。,意讽限幅檀岁彬钾龟笺刹援柜韵斧礼瘪叮烙存款误嚼息胁妙铅蔬希区毋挖氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,3、2 试样前处理的方法,第三节 试样的前处理方法,（1）酸水解,盐酸水解法 被破坏的：Met、Trp； 不易水解：Ile、Leu、Val。 过甲酸氧化法,巷筒探躲手碱愧恤掺恕少积肺古植纵朝诚秦佳伴丁宛归糕因卞撞歧椎搽臀氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,（2）碱水解法,第三节 试样的前处理方法,（3）血清与生理体液样品的处理方法,血清样品：加入磺基水杨酸钠，混匀，超高速离心，取上清夜。,生理体液样品：除去蛋白质、脱盐、脱色。,擒秃湛煌钳醉梁沽固豆浆事鄂震权炼编廓待阳磕或同徒妮字任短茁矗朗蚁氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪,