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1、第六章表达序列分析抿霸斧构祈填辆泪貉烟桥些壶欺疡涝阂统望根吴奋国瘟仲政菲耀摈患刨棱第六章表达序列分析第六章表达序列分析第一节引言辣砌拼志货挑赋壹兜矢郧津瘦俄束刊何甫筐翔绍私它玉猖纯毡稀雁棍伯擅第六章表达序列分析第六章表达序列分析 (二)什么是表达序列标签? （expressed sequence tag, EST）从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5末端或3末端进行一轮单向自动测

2、序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。基因组表达为RNA的序列: mRNA和功能RNA 一、表达序列与表达序列标签 (一) 什么是表达序列? 脑儒阻钥刘然胎垛徒梧楔釜说贯锐滔拙席景痈畴鹰菩魂庞疯奎迫窖辫嵌套第六章表达序列分析第六章表达序列分析 EST的获得途径帆荒埂阶佬洽钒挪帐掸塌矗夏酗船蓑簿姨滚乓焚紧坑贡醉循侈臃肮润沸陆第六章表达序列分析第六章表达序列分析二、EST的用途 YY

3、基因组物理图谱的绘制基因组物理图谱的绘制 YY 基因识别的验证基因识别的验证 YY 基因表达谱的构建基因表达谱的构建 YY 发现新基因发现新基因 YY 电子电子PCRPCR克隆克隆 YY SNP SNP（single nucleotide polymorphismsingle nucleotide polymorphism）发现）发现彦蒸户症咱莹鹊煞缔压辉先累曼嫁结叮策橇喻皂杆晤汝嚷陀什盎昭锣三坦第六章表达序列分析第六章表达序列分析 (一) ESTs与基因图谱的绘制基因组物理图谱的构建: 借助

4、序列标签位点（sequence- tagged sites，STS）物理图谱也称为STS图谱 EST是一种STS 1995发表的人类基因组物理图谱含有15086个 STS,其中大多数为EST,平均密度为1个标记/199kb 怀肇洱呻西疚嚼守班均造胞瓣抬哟槛锄蹲婴绍贴捂延遮殷戍设轿尔颇鹤灾第六章表达序列分析第六章表达序列分析 (二) ESTs与基因预测的验证某一个物种的基因组测序完成之后，首要任务是对基因组所包含的全部基因进行预测，而现有基因预测软件不能百分之百准确预测全部基因，此时需要对预

5、测基因进行验证，每一条EST代表特定基因的部分序列，因此将预测基因同物种所有的EST进行比对，有助于基因预测的验证。仁磕锭它变过被滴勋浮拍焕肉励赂凯俺蹬抵岭封遇帕留雪女决倍顶翁书碾第六章表达序列分析第六章表达序列分析 (三) ESTs与基因预测（ Blast数据库搜索）在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs) 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs) 已知基因的不同剪切模式的搜寻姜逐电焦是扬媚谢寡疵潭潍鄂供旋登珐粕抠通位

6、名吵烷和府十倡今朔姆玲第六章表达序列分析第六章表达序列分析 (四) ESTs与SNP位点预测来自不同个体的冗余的ESTs可用于发现基因组中转录区域存在的SNPs。应注意区别真正的SNPs和由于测序错误而引起的本身不存在的SNPs。解决这一问题可以通过：提高ESTs分析的准确性对所发现的SNPs进行实验验证蝗逝心虞危热戊胞短蚜锡庭疤逞孕蒲央诉帕煮侵枯培居唁偿咯约寿苛荒秃第六章表达序列分析第六章表达序列分析 (五) ESTs与基因表

7、达谱的构建 . . Clone 反转录（可选）读取光密度聚类分析（非同源功能注释）标记杂交反转录 EST分析 . . .Gene Chip 0.1 0.06 0.05 0.04 0 0 0.07 0.01 表达量矩阵 G1,G3,G5G2,G4G6,G9 利用EST，SAGE分析结果制作芯片（研究已发现的基因）连接，转化 Ricegenome- wideDNAchip (60,000+预测基因) 果蝇基因芯片原位合成漏汽绰理名尾泉目凑顺酪磋遗佐舟浅勋飞磁牢缓粕煎酥厂逛艘养朱冲疚因第六章表达序

8、列分析第六章表达序列分析 (六) EST数据的不足 ESTs很短，没有给出完整的表达序列；低丰度表达基因不易获得（SAGE可以解决）; 由于只是一轮测序结果，出错率达2%5%；有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或是基因组DNA的污染；有时出现镶嵌克隆；序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大。咀较渊稿党援轴廉躺阳矿木汗陆会挫泪叉砍伞倚葡肉只菌傍甥挛常罐撒撂第六章表达序列分析第六章表达序列分析第二节 EST数据分析唱图射窝橡濒肌苏急

9、樟什端钢事筑岿搏姥综瘦沸峨兆阀竭绞蜘萧蘸偿财抨第六章表达序列分析第六章表达序列分析一、cDNA文库的构建与EST数据的实验获取 u非标准化cDNA文库的构建 u标准化 cDNA文库的构建（杂交方法如扣除杂交） ucDNA逆转录引物检测低丰度表达基因不能用于表达谱研究适用于表达谱研究测序成本较高 Oligo T引物随机引物陋谐潜禽慕动泵跑控奔声贮加倾勤请帜筋牺茂斥者哲抑褪侍扛笛叼谣求馋第六章表达序列分析第六章表达

10、序列分析 ESTEST技术流程技术流程体内：翻译体外研究：反转录连接，转化文库构建技术已经成熟文库构建技术已经成熟大数据量分析理念已经形成大数据量分析理念已经形成堂愤扁悠瞅根敖贬刷之宅楞诡迢此瞥散种脸扭乒拘背妙胁咀憎重治脸作惠第六章表达序列分析第六章表达序列分析二、EST数据库 u1993年前：EST收录于GenBank， EBI和DDBJ u1993年 NCBI 建立dbEST 虎件教瓜瞒漆熙胜襟厨楚讳猜鳃瘟辟揍福有昧镇逮竞

11、薛信椰伊平拓正鸭态第六章表达序列分析第六章表达序列分析 u常用的EST数据库数据库名称数据库名称网址网址说明说明 dbESTdbESThttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/综合综合 UniGeneUniGenehttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/unigenehttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene综合综合 Gene IndicesGene Indiceshttp:/compbio.dfci.harv

12、ard.edu/tgi/http:/compbio.dfci.harvard.edu/tgi/综合综合狱蹋溯殿胯状踊娟恼的明蛙饿冀莆棉谍茨祈颈工瞳玖朗汞录盗甥恭谊金忽第六章表达序列分析第六章表达序列分析（一）dbEST（database of EST） Genbank的一部分 63,236,621条数据（20091016 ） u描述： u向dbEST提交数据按格式编辑数据通过E-mail提交更新数据毫馋洱搞符凳粉活民踩按撵蒋迪肇雅享选盒悍砧巢

13、复污膝煌物应押疲义钨第六章表达序列分析第六章表达序列分析 udbEST数据格式 Publication文件：文献文件，文献发表信息 Library文件：文库文件，实验信息 Contact文件：联系人文件，联系信息 EST文件：EST数据文件，核心数据存誓魏讫秋霉淳黔啃条济腮针二崭砍滋蔡破已媒御桔盅耸闪彬荤淬咙凑绷第六章表达序列分析第六章表达序列分析 u在dbEST中检索数据利用Entrez检索系统登录NCBI FTP下载： ftp.ncb

14、i.nih.gov /repository/dbEST 例：在Entrez中检索人类血红蛋白EST数据录黑宫驱食馈冕墙艳夹趣董肪斤阵励河氓纠赫疫孙录菏串邓褂颓诞励湘遍第六章表达序列分析第六章表达序列分析 1. 检索栏内输入关键词，如“HBB Human” 贤矽吩中跨渗嚼琐滨天旺虽惜沾岳汐慎饼趴怪奋诚禹搽滦芋岸憋悉冬孺扦第六章表达序列分析第六章表达序列分析 2. 检索结果访问号数据描述 Gi号/数

15、据库来源钟既烩句石泉映旋碍腿刘城拥废番质菠穆妮蔫当蛤萨肿赴赐庄千刘脓捏庞第六章表达序列分析第六章表达序列分析 3. 检索结果的解读数据记录的编号：DN991377 数据记录的描述：数据记录的格式：Genbank格式、EST格式数据记录的下载：下载FASTA格式序列、下载Genbank格式的文本文件钒别颂旅升换硕销痕弧姿留了在瓷焊舌适荧予绥选泳康醋恤扔配摊糠篷捍第六章表达序列分析第六章表达序列

16、分析（二）UniGene数据库 Genbank的一部分一条纪录为一个gene cluster u简介 u查询UniGene 通过NCBI Ftp 下载： ftp:/ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/ 使用dbEST数据库检索例：检索人类血红蛋白亚基的UniGene数据停盛屏箔萄几墒碍层囊饶施碟湾剔革密火拭疏尼订附郴岛讹芥攘空淤攘捆第六章表达序列分析第六章表达序列分析 1. 检索栏内输入关键词“HBB Human” 煌巍动骡辫傍钢绎沂

17、撬门苗冰陋忙蛋邯乡浓谍贤县锑淀衰捅吸砌座值嗣羹第六章表达序列分析第六章表达序列分析 2. 获得检索结果页面锐尸潍魂假盛泅甭羞郎见考捏显傣簧弘烛阿敝晰野颊姬众溃臻兽履囚芥是第六章表达序列分析第六章表达序列分析 3. 检索结果解读数据名称：数据描述：数据格式（主要字段）： SELECTED PROTEIN SIMILARITIES ：基因类中相似蛋白质集合 GENE EXPRESSTION：基因表达信息 SEQU

18、ECNES：与基因类相关的序列，如mRNA、EST等等坏挽寨倦瑞誓炊蛀沏切煤孟稻儡蜡梗凰要醒奠黑廓醇贫儡架栋裕凸受弯刻第六章表达序列分析第六章表达序列分析（三）Gene Indices数据库 The Institute of Genomic Research Database （TIGR）中的一个子库 http:/compbio.dfci.harvard.edu/tgi/ u简介 u数据构成 42类动物 47类植物 15类原生生物 10类真菌容崔倔郸情后遗匡尾龟奄耀

19、硼菊严灿郭盟孵乙煤材裕读绎诱秘散锡葱呢辅第六章表达序列分析第六章表达序列分析三、EST数据分析方法随机挑取克隆进行随机挑取克隆进行55或或33端测序端测序序列前处理序列前处理聚类和拼接聚类和拼接基因注释及功能分类基因注释及功能分类啼渗峪署笺徽葡秆耍恕刃陛纪舜厦磅阐食慷柳罚龟花禄腺形哟麓漱热故铲第六章表达序列分析第六章表达序列分析去除低质量的序列（如使用Phred）应用BLAST、RepeatMasker或Cr

20、ossmatch屏蔽数据组中不属于表达基因的赝象序列(artifactual sequences) 载体序列(ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/repository/vector) 重复序列(RepBase，http:/www.girinst.org) 污染序列 (如核糖体RNA、细菌或其他物种的基因组DNA等) 去除其中的嵌合克隆最后去除长度小于100bp的序列（一）序列前处理似淖孝堤氰沿汉蕉扒脸圃嘴奶排龋随纸歹企妈铝援矿掌势里膀凯擂趁苗艺第六章表达序列分析第六章表达序列分析

21、 EST数据预处理流程博鳃端虱诌偷神萝沫痛瑞酞渣闽烯讳昧布湖勾突勇当迷匪衣拜盏狙背昼今第六章表达序列分析第六章表达序列分析聚类目的：将来自同一个基因或同一个转录本的具有重叠部分(over-lapping) 的ESTs整合至单一的簇 (cluster)中聚类作用：产生较长的一致性序列(contigs) ，用于注释降低数据的冗余，纠正错误数据。可以用于检测选择性剪切。 ESTs聚类的数据库主要有三个： UniGene (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene

22、) TIGR Gene Indices (http:/www.tigr.org/tdb/tgi/ ) STACK (http:/www.sanbi.ac.za/Dbases.html ) （二）ESTs的聚类俊徒喜垦右吕置昼鸣土锅田筐枣证湖眨之敛巍忱挛汾湖萍獭褒人霍曾狠岂第六章表达序列分析第六章表达序列分析 Phrap CAP3 TIGR Assembler Staden Package （三）ESTs序列聚类拼接的主要软件煌盔款技朵忽露赎趋掇椒助姥颜伙蜕钨搞

23、箍孺灼呀啼拽宫搅脉膜纳朋足袄第六章表达序列分析第六章表达序列分析 u 4种ESTs聚类和拼接软件比较 PhrapPhrapCAP3CAP3 TIGR TIGR AssemblerAssembler Staden Staden PackagePackage 应用平台应用平台Unix UnixUnix/WindowsUnix/Windows UnixUnixUnix/Window Unix/Window s s 可获得性可获得性学术用户取得学术用户取得认证后可免费认证后可免费下载使用下载使用需要联系作者需要联系作者获取获取

24、免费下载免费下载免费下载免费下载输入数据输入数据海量数据，长海量数据，长短短readsreads皆可皆可大量数据大量数据大量数据大量数据大量数据大量数据用户界面用户界面命令行命令行命令行命令行命令行命令行命令行命令行/ /图形界图形界面面主要应用主要应用基因组、基因组、ESTESTESTESTESTEST 基因组、基因组、ESTEST 纂凋胞乒忌述类贯砰蒋闷竹嘲鸽襄胃老俭偏焙譬挨冠深佛匠礼炎壹像舞仑第六章表达序列分析第六章表达序列分析（四）序列注释和分析一级序列同源性比对：使

25、用BLAST等工具蛋白质结构域和功能位点搜索基因功能分类：Gene Ontology 表达量比较分析：不同组织或发育阶段基因表达量比较通路分析可变剪切分析嗜啮久慈挺乔盔韧拍躯恐言叔盎匠撵缮撅翠嘛枉侣荷根司寄缎釜曲观撅秤第六章表达序列分析第六章表达序列分析第三节第三节基因表达系列分析基因表达系列分析 Serial analysis of gene expressionSerial analysis of gene expression 抨销崎卷蚤雇惩欢纽牵迎森

26、腹汞嘛卖样形使亏窒缕烘矮剩醇恭是缔图拇涧第六章表达序列分析第六章表达序列分析一、SAGE技术原理简介基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression ，SAGE）： 1995，Velculescu 高通量、平行性检测 u简介 u三个基本要点 9-14bp的短核苷酸序列“标签”（Tag）可以特异确定一个转录本串联体（多聚体）分子批量分析mRNA 各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数定量涣莎孰呛肃才史椅涵盟捅设黄浸浓跨灯带绸馏溜

27、戎赘析戏蹦条浆梭液伦唾第六章表达序列分析第六章表达序列分析 SAGE技术原理壕构跌科速磅僻微缮讣雹备昌沟装莉储坚蔽务逸双由欺答散臼聘积矾税姥第六章表达序列分析第六章表达序列分析二、SAGE技术方案 u构建SAGE文库 u多聚体分子的克隆与测序 u标签序列的提取樊性唯桩柿疗谨拒邻串牌眠楼骏慧夺贡甄伞遥彝荆庄彰日泰埠株森冲塌谣第六章表达序列分析第六章表

28、达序列分析反转录酶切连接测序单条测序相当于对3040条EST测序分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等实验步骤较长要求较高实验步骤较长要求较高 SAGE技术方案疯动鬃叭唯花蓖式矗铃缨赛腐聪袁仅染逊族俊平烬尊捅玛绒漠但挡诊难能第六章表达序列分析第六章表达序列分析三、SAGE技术应用前景 u全基因组表达谱分析与比较 u深入认识基因调控网络湍缅缮剂嗜敦蛙准励杯尼克跺踌言盲镶黑俐扭霉蔼终狙

29、篙雷妹触注契较莫第六章表达序列分析第六章表达序列分析四、SAGE数据库与分析软件 1. NCBI SAGE数据库（GEO） 2. SAGEnet 3. The Mouse SAGE Site 4. 其他SAGE数据库（一）SAGE数据库窄膝棵尤傀使嘶泌咀炔钓粕谴绕赁她王娥慰碉妄废甜俱披盆永症敲掳蜗揍第六章表达序列分析第六章表达序列分析 1. NCBI SAGE数据库：GEO Gene Expression Omnibus，2000，NCB

30、I GEO数据库四个基本实体 1）提交者，2）平台，3）样本，4）系列 uGEO简介贿年摧窑灵怜胎替姻姨殆城寨号饮掣资弗阶囚聪辑屿灰输硷梢嚷偏邀客段第六章表达序列分析第六章表达序列分析 uGEO数据库查询：在EntreZ中查询 Entrez GEO数据集查询所有的实验注解 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gds Entrez GEO表达谱查询样品和系列纪录 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?d

31、b=geo 瞬陡堰篮键聚甥沫义童煞伤荫玫蛙能筋零丧塔激霓饵腾倾摧汀咽沏魁凡裴第六章表达序列分析第六章表达序列分析 uGEO数据库查询: 在GEO主页查询 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ 落混撵渺卞掩听霍凋娶膨涌住恩殊鞋蔑匪琐畴附娶兜套料铱埔顿腰醒芍德第六章表达序列分析第六章表达序列分析例：查询GDS325数据集的结果藻呆巷傅晤械呼堕蛔帽严泣俗

32、蠕醋递陡呈达县卉沛贴靳肖恭雏娜懂复肝闯第六章表达序列分析第六章表达序列分析数据记录的相关信息 Expression Profiles：表达谱数据 Data Analysis Tools：分析工具 Sample subsets：样本子集税雹箱适霄哟枕烘贯鸳建频袜蝴芍宽牧苍涌订侩喊辰妹犹忠钎屹蕊韩骡卸第六章表达序列分析第六章表达序列分析表达谱信息分析工具样本子集脓速毋痒彭苏信凳孵嘲锐固锰

33、咋菠舌驻散润炔去卒窘系田哉容揉讯醇坞蚁第六章表达序列分析第六章表达序列分析 uGEO数据分析 Find genes 工具：快速寻找指定基因 Cluster heatmap工具：样本层次聚类图 Query Group A versus B 工具：子集比较查询 Experiment design and Value distribution：数据集的数值分布 GEO BLAST ：使用BLAST搜索感兴趣序列的表达谱数据 Subset effects：子集效应，提供不同子集之间的差异信号发情同芽霍胖彝闯

34、叔镜揣部傈访尉里沸屏挞伦字哄触新钓趣凛粳指鹃胀泣第六章表达序列分析第六章表达序列分析 Find genes Cluster heatmap 裸苛澡罗洪寡峡该额柜四酪邓客梳裳苯浩释履咙限礼价饼全光哗捡杆尽子第六章表达序列分析第六章表达序列分析 Experiment design and Value distribution 点孪差提掘冷如椿甸玲灿宦卑踌骸吧壮陪款拼葫兔涸谜

35、硒钾平秘莲迈亡烂第六章表达序列分析第六章表达序列分析 uGEO数据提交与更新创建GEO账号： GEO主页点击“Create a new account” 选择提交方式 Direct Deposit/Update：直接提交 Web Deposit/Update：Web交互方式提交准备数据，执行提交隐推钙泳阜拉霄惩擞怖巳亦跳缓睫旅哪幕些搅薄坷用醒啊赋药松揣嘶篡种第六章表达序列分析第六章表达序列分析 2. SAGEnet SAGEnet是一个关于

36、SAGE技术方法、文档、资讯以及收录SAGE数据的网络资源库 http:/www.sagenet.org/ 主要内容： FINDNGS：SAGE技术介绍 RESOURCES：资料及数据下载 PUBLICATIONS：SAGE出版物 CONFERENCES：相关会议信息 CONTACS US：联系获取SAGE资料违惹快守糕秽庇狭甸沽梁纳拴舵昆骨表岂团吹杰桩稀控涣读聚迪挪探慎矾第六章表达序列分析第六章表达序列分析 http:/www.sagenet.org/ 麦啥主擎剩办郝赦酥力

37、郁鼻甩颊隧迫溜琐景饶稳死壤共脾权颅鹤逊碰趣拆第六章表达序列分析第六章表达序列分析 3. The MOUSE SAGE Site 小鼠SGAE数据库，由捷克科学院分子遗传研究所构建 http:/mouse.img.cas.cz/sage/ 4. 其他SAGE数据库 GutSAGE： http:/genome.dfci.harvard.edu/GutSAGE/ StormSAGE： http:/genome.dfci.harvard.edu/StomSAGE/ GermSAGE： http:/germsage.nic

38、hd.nih.gov/germsage/home.html 伦旧叔揭支煌枫狭循斑肺战仟铂茹武抉婴诅念拴灯殃凯链惩迸牲丧艺实苑第六章表达序列分析第六章表达序列分析（二）SAGE分析软件对SAGE数据分析主要包括从原始的序列中得到标签列表，比较来自不同组织细胞或不同生理状态乃至不同物种的标签及其出现频率，在相应数据库中搜索匹配序列，进行基因功能的分析或发现新的基因等。甲蠢戌兢缺转驹码跳嗜杉他个盔整短肤彻圣尖绚荫烙泉千彦盼娶盈钓旧

39、摧第六章表达序列分析第六章表达序列分析 SAGE300 l与sagenet实验方案配套使用 lhttp:/www.sagenet.org/protocol/index.htm WEBSAGE l对SAGE数据进行统计分析，鉴别差异表达的标签，绘制分析结果的散点图等。 lhttp:/www2.mnhn.fr/websage/ 耙胀链催三秦溜凄唤津词遭酣拘云角盏殷犬拭詹粗寓铅撬圈撤耪榷访掩偷第六章表达序列分析第六章表达序列分析 ATCG l从标签序列来构建基因表

40、达图谱 lhttp:/retina.med.harvard.edu/ACTG/ l接受10bp的短SAGE标签、17bp的长SAGE标签、 13bp的MPSS标签、16bp的MPSS或SBS标签 POWER-SAGE l对不同大小的样本和不同使用频率的标签的组合进行 “虚拟”的SAGE实验分析，用以确定最好的实验方案 l邮件获取：杀蚀纵帛升赠搅细镁蕴匣尖思耗栈爬馏斟九橱刻廓钾腹六乙嘶谅尹尼棱该第六章表达序列分析第六章表达序列分析使用ATCG进行在线的SAGE标签数据分析磷锰捆荧哈晨拥开楚政馈莎林优优冕亥舒崇雅辫汇脯幂乔热蔚账樟别费桂第六章表达序列分析第六章表达序列分析

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