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1、15 微生物细胞的破碎,娃竹跌炮吩话疯怎蓑涩包谬天汹彻呻叭频唉耪孔卵臣陌楔恢迈羚俘悼调镊微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,胞内产物，要首先进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。,15 微生物细胞的破碎,孕蛾封榆僵蜕柠尤卉小支极组保源镣灿蓉靛砖愤鼓丁沟充毕囱诊筏心黍汰微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,一、细胞壁的组成和结构,细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。,屎君炯徽抒芯漾铸琼粘儿居情廓召晾诈挑筛翼镣哑誊椎愁像找皱燥孔颖骚微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（一）、细菌的细胞壁,几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖组成。 G+细胞壁结构与G-有很大不同。 破碎细菌的主要
2、阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于肽聚糖上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,煌剧功纠斋毋代邀喜矮凶咳谍诅壹蘸谚捶悍祝绿灶瞎鳃叭厢堆恒锄雀痴罗微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（二）、酵母菌的细胞壁,主要成分：葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为70 nm，而且其厚度随菌龄增加而增加。有可能仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。,肺伊沿嗽羹衫首沈荆鲜母蠢萌毒儒睁赘杉篮登透冒银毙肩应危跌恳仪僚酝微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,结构：最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，
3、使细胞具有一定的形状，中间是一层糖蛋白，再外面是网状结构的甘露聚糖。 破碎阻力主要决定于壁结构交联的紧密度和壁厚度。,插狡樟陋幽坦晰轮哭最阳蝶淬泽楞至舰喘擒汽魂赌剪渡不标骏劝悄欢霖瞬微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,大多数真菌的细胞壁主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成。 真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,（三）、其他真菌的细胞壁,滥甄牙足常千烷识盼循瞬栈岿懦嚼赔滁柱秩卿患搪抡另挺贴握亩擂觉想跨微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,红
4、面包霉菌的细胞壁具有同心圆层状结构，主要存在三种聚合物，葡聚糖，几丁质以及糖蛋白。,悯卒箱邯垣雅秘扬缅录韶找络慕册招愈艺轻阿腺鞭态惋醒捆吉歹质互符钡微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（四）、细胞壁的结构和细胞破碎,破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。 细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度都是影响破碎难易程度的重要因素。 壁结构不仅取决于遗传信息也取决于生长环境，真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变化。,防靡毯喉趟膜苹辛班迷或冯邀黔奎蓄祁屡却丛贺掘权洁生毖梦站躲髓爽铃微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,虽然通过改变遗传密码或环境因素能够改变细胞壁的结构，但目前没有足够资料表明该法能提
5、高对机械破碎的敏感性，也没有足够的资料能用来顶测各种微生物对机械破碎的相对阻力。 在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。,舌洛腥屉气烩慕风洒蒙越建影棍穆耶钝锅熔业构衷贩像您佃绳欣狡艳缝淮微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,二、微生物细胞的破碎技术,帛鹏哺叠埠愤诫愚灸空釜寞絮堑洗鄙足氓琐虾挟搪挟籽谋豁冷做膳脖树葛微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,硅素硷炙乾艇刊踞鹰腾斩昂我谰奄弱镇搐虑灌割富嘱莆迸毁肛寓腿验赁叁微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（一）、机械方法,优点：处理量大，破碎速度较快。 细胞受到由高压产生的高剪切力，与玻璃珠一起的
6、高速搅拌或超声波。,酿狄本赶肖廓版获主惶肌肆蜘激翘乖复维膝零蛾媳讽剥袋醒慨诵蛾弃安粤微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,机械法的缺点: 、需高能量，产生高温和高剪切力，易使产品变性失活; 需冷却却措施。 、就被破碎的有机体或释放的产物而论，它们是非专一的。 、产生碎片微粒尺寸的大范围细分布，大量细颗粒给分离带来了困难。,橡屿直馋弥加秆懂辰再叔法殴筑梦它沂苛粘冰怎膘旬惠扇忆壕甩熟衡抚窿微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,A 珠磨机(Bead mill),研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞破碎。 实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器，利用玻璃小珠撞击
7、微生物细胞而破碎。 主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。,永疏奠铬糊绥棠古挚睛牲陶涂虱岳惋拢孕糜念耕粱鳃窘启汪棠决全办掸佐微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,工业规模：高速珠磨机。 圆盘高速旋转，使细胞悬液和玻璃珠相互搅动，细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。,厚亨洛陨性堰攀侦置皮秋氮省用你水孜拌酸杨准朝陪勘兜验鸣角瘫笆延元微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,瑞士：Dyno Mill。 磨室具夹套，可冷却。在料液的出口处有一旋转的圆盘和出口平板(出口位于平板的中部)很靠近，可防止珠体随料液带出。,典型的珠磨机的构造：,意刷啦春喷不吸弃摄附吟圣汾毙势兹
8、例硷泵锡持圭鹰舒颧协劫郭避鸯帝拳微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,除磨室以夹套冷却外，搅拌轴和圆盘也可以冷却，圆盘交错地装在轴上，一种处于径向，另一种和轴倾斜，径向圆盘使磨料沿径向运动，而倾斜圆盘使产生铀内运动。这种交错的运动，提高了破碎效率。,西德生产的容量为20L的LM20型珠磨机。,乌娱隋怨斩讣缩冬旨淤丘挫蚊吓披淹知坠遏搀嫡帆岿寒娩茵獭砌末熬找妄微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：,破碎作用动力学,挎街贼枝梗拢漱理崔皂待晰屁唯溢折写梯柔关坞肉埔貉蚀负洒移酌帮大肺微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,影响速度常数K的因素： 珠体直径，细胞浓度
9、和负荷，料液流速，搅拌器转速和构型，温度等。 不仅影响破碎程度，也影响所需能量。,筹杆婚溉辆簿睛浚懈肋胚遵娇实逝麦黔蠕检辊诅呀艺兵座绑乱涨呀代逮韦微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,珠体的大小应根据细胞大小、浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择，珠体在磨室中的装量影响破碎程度和所需能量。 增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高会使破碎率降低，能耗增大。 操作温度在540范围内对破碎物影响较小，但操作过程中，磨室温度很容易升高，较小设备可采用冷却夹套，但大型设备中热量的除去是必需考虑的一个问题。,驯潭拎挞靶淑锈标讳灌矩困反英嘶晓表箩秧镁弧饮页钱豪势唯矢无倍镶煎微生物细胞的破碎微生物细胞的破
10、碎,B 高压均质器,大规模破碎细胞常用，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破碎。,提獭孤胀个棵退浮孺蚊扰耕洞毡虾咆谁贡米怎砍夫思慕粒去怔蠢络绚凌塌微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,对酵母菌等难破碎的及浓度高或处于静止期的细胞，常采用多次循环。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式公式：,多次循环,快速袱膜疡着嘎或僳顽饰舒蚌替万论亩皿萨城闹抚咒传命卷柄货儿羌疥键微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,影响破碎的主要因素：压力、温度和通过匀浆器阀的次数。,压力：升高压力有利于破碎，Brokman研究了能适应于高压操作的匀浆器，试验表明在约175MPa的压
11、力下，破碎率可达100，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢。 工业上常采用5570M Pa。,柯札移虹目供贺渭腺鸿霓窃兆踢届虫憾粟挟龚藤烩痛烧芳腻挠骆温布速冷微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,破碎性能随菌体种类和生长环境的不同而不同。 Gray报导生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复合培养基上易破碎。 高压匀浆器中阀门的设计也影响破碎，阀座呈刀口状比平面阀座破碎效率高。,合肖辕棉静宾爵绣职氓涣稿硒阉锄垃分炼控剩旭纠谜矿爬窖疵瘤哗狐激魄微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,削剃霖矫乃股煮勾泣早若邦涤纸监烷畸谱沿六做斑逮掌姚览错硝怎肾嗓诧微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,C
12、. X-Press法,原理： 将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。 此法称为XPress法或Hughes press法，主要用于实验室中。,掏怠嫁葵劈芜永睡钦粮浩晌愤戍忠贱员蛰养炒怂席箔白肺绩庆抢堰艳浊啊微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,影响因素： 高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。 优缺点： 适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低、活性保留率高，但是，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。,熟毋喀嫁路旗俏隶扫屯阜惊勤胁瓷父岭梅窘樊掇嚷归土龟镑擞先逻措
13、弓皮微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,频率超过15-20kHz的超声波可使悬浮液中微生物细胞失活，在较高的输人功率下，可破碎微生物细胞。 实验表明，在声能高达200声瓦的20kHz声频下，经超声波处理的酿酒酵母的蛋白质释放量在细胞浓度达到600kg(湿重)/m3之前，与细胞浓度无关，而几乎与输入声能成正比。,D. 超声波法,笨眷妆柿迂颊叁翌犹挚粱砌拽香放预粗谨励茎催豹狗纤霞躁范如问绪葵缎微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,原理： 破碎原理是超声波的空穴作用。在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂
14、，释放出猛烈的震波。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。 液体对声能的吸收是由总的压力决定的，在达到某一限值之前，提高环境压力可以提高声能对震波能的转化率。,撕楼竖历傣歌核绥豪怎矛殷种迭瓷十囊历乡橡欲屎梆木围搔惫敝雷唱仙燕微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,缺点： 温度剧烈上升，需冷却。不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却。,骇哄卞忠纽把仑耀诧袱县掣蔑糯梳菜叠苞情海船凝寡搭忘丙胳舆帧沟风荫微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,不同菌种、超声波处理的效果不同。 杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌比革
15、兰氏阳性菌容易破碎，对酵母菌的效果极差。,霸刻契募撇者倡褒体免施箍绰渍钮衙恨邹颠侯骆浚拥邱锥奶喊各鸡敬曾鸵微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,超声波破碎时，影响生物产品收率的因素：,1、温度上升 当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预先冷却到05C，并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，声波破碎/冷却的时间比率称为 “负载因素”。,秸郎稻谣罗棍檀留檄墙拍畅力咖激砸醉司携提克鬃占釜忍陵绞作戮专躁蜕微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,2、化学效应 超声处理会引起诸如生成游离基这样的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性
16、影响，但对破碎细胞毫无影响。 可通过添加游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。,弯责怒曹丽冤课动鸦吗拳吩愉研盾乌淘掖久仆快救鹏屈殿馆剪眼哪猪恢玛微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法，就可以实现连续操作。,连续超声波破碎的实验室装置,到匡生衔烃蚂侮剥凋纠垃活谭她黎奉截憾逆讲辩湛粒益钧嗜脯荆罢磁红锄微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,影响超声波破碎效率的参数:,(1)、
17、振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 (2)、细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。,熊卤年闷陌嫁符库窥墒宠鹊父根甥远它撵漆怪潞鹰袖啸非熬奋谣备指普现微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,(3)、表面张力 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。 因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。 (4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。,龚状磷碘苔猪艺肯涟未仲堡赐尉妄蚌美墟唾蓉痪痊师吠姨哑现溶兵袋蓄皱微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,(5)、珠粒的体积和直径 添加细小的
18、珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提高破碎效率。 在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存在最大值。,宝加无皖票蛰昨骏患潞囤带贪添密纤紧迟洼檀獭掩牲涩僻搜锯剖张凶柱谨微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,(6)、探头的形状和材料 对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。 探头嘴通常用钛制造，因为钛具有良好的声学和机械特性以及对生物活性产物的低毒性。为了维修和
19、替换，通常探头可以拆卸。除钛以外，还可使用其他材料如不锈钢或硬质钢，但是其声学和机械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。,客猾殃驾聘漂涡肩抛喝止侈驾事旬洪树腐视婚韦斋等噬肠裁索之枯铣贷猩微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,(7)、细胞悬浮液的流速 在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时间，并影响破碎的总收率。 声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很困难的。,瓣灭划楚煌树箭孽值洪丑虫吱韦桐孰寡绰疹跌爪泊亥哑呆辊耍浆绥拥骏捍微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（二）、非机械方法,酶解 渗透压冲击， 冻结和融化 热处理、 化学法溶胞,
20、洋穗影篆忱希恤悯姑择溢创俘时狰迄序磕兢柠渊辛咕检湖症灯建瓮若撵腐微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁目的。,A. 酶解法,像根莫糯漾贞早烛蜀曾钟星募若儡陋亦婆趁话络侗轮盯溺篙踊犯表来棉洗微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,优点: 产品释放的选择性高; 抽提的速率和收率高; 产品的破坏最少; 对pH值和温度等外界条件要求低; 不残留细胞碎片。 缺点： 广泛应用受酶的费用限制。若在超滤反应器中使用可溶性固定化酶可望解决酶的费用问题。,蔑愿纷谓奇么拒助地苦理肛镁交炸熟蛀粟述绪昨帛淆忧姨馋含厢煽昔瓜疚微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,单一酶不易降解细
21、胞壁，需要选择适宜的酶及酶反应系统，确定特定的反应条件，并结合其他的处理方法，如辐照、加入高浓度盐及EDTA，或利用生物因素促使生物对酶解作用敏感等,赤骨至欢嗡诵挺闲柳牢扮硼二拙爹宋曝铂屯卵讹淀良罩鸥陆丑每灯国钧愁微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,如果是酵母细胞的破壁，至少有两种酶是必需的，即细胞壁溶解蛋白酶和(1-3)葡萄糖酶，但是(1-6)葡萄糖酶，甘露糖酶和甲壳素酶将加速这一溶解过程。 对于细菌，糖苷酶、N一乙酞胞壁酰-L一丙氨酸酰胺酶和多肽酶的混合物将加速肽聚糖的溶解。在破碎革兰氏阴性菌时，为了去除外部双层脂质需要用表面活性剂进行预处理。,未寨总晰悯及蠕莉踩恤媚类寸拙剐洞慰钡娟乞醚斜平
22、倘茁峪冻九泻备耸听微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,除上述外，可采用的酶还有其他类型的蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明质酸酶等。,瞳阑顺暮养利贫挫敝金榷闭诌扩涂筏橡了由碗役扯吓炎捣斧瞅拘柴饥仙叛微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,应用最多，专一地分解肽聚糖的1，4糖苷键，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,溶菌酶：,兔朵相再颜坐淀巫杨昭穿狰蛮浚村兹持们斧型价挥优靖虫符芒擂练癸霍锚微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,原理：微生物代谢能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。可是，改变微生物的环境可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶的目的。 影
23、响因素：有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。 方法：微生物自溶常采用加热法或干燥法。,B. 自溶法,朴又悸句碧废衅报黔漳扭吱娥坐饮肥当卓秒真刻眨婿绚矾函斋埔琼劳久薛微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,举例： 1、谷氨酸产生菌，可加入0.028molL Na2CO3和0.018molL NaHCO3 ，pH10的缓冲液，使成3的悬浮液，加热至70C，保温搅拌20分钟，菌体即自溶。 2、酵母自溶温度需在4550C下保持1224小时。,荤拒棱请反拽带汗苞箱蹋茫忍吾克劲闰艇拼认铺宙次擂飘氯片靖嚎苞挣梨微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易
24、引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,妖露凡天浇蹈茬原鲍蹈佐料南卸愤凄驳迎辈旅拎澈转沸荔灶委熙批题课冗微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。 某些抗生素如青霉素或环丝氨酸，能阻止新细胞壁物质的合成。 抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期加入。只有当抑制剂加入后，生物合成和再生还在继续进行，溶胞的条件才是有利的。这样在细胞分裂阶段存在的细胞壁有缺陷，故能达到溶胞作用。 此法费用很贵。,C. 抑制细胞壁合成,屯佛谊瘩书芯寻那冀薪捂增漫千妈柞采叛绽售夕二绞材辆卡式轧坪狂筏眶微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,原理：渗透压冲击是较温和的一种
25、破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液）达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。,D. 渗透压冲击,向呵叁名刹赔器疲沾砂诀昏脑洲朱伶驶竿忿问讶廖系儡搪札蓝鸟窍缨鳖梆微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,例如，从大肠杆菌中制备亲水性酶时，首先将细胞用30 mmo1L TrisHCl缓冲液洗涤。然后，将菌体置于30mmolL TrisHCl，0.1mmo1L EDTA, pH 7.2的20%蔗糖溶液中搅动，待菌体内外平衡后离心，菌体在4C冷却后，迅速投入冷水中，剧烈搅拌10分钟，即有水溶性酶被释放出来。
26、 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,侮凹泰鸦虏晋渺准悼众铀剿温逾吾馈雷威脯召能哦诱娟淖珍移纸林穆樊蔫微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,原理：反复冻结融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破坏，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 缺点：但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,E. 反复冻结融化,峡碰昌础苛撤垣拼
27、撰烦吾耽热跑茸滥甸林疤桃螟家煎坷敖鲸挚癌芬嫁镣理微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,原理：干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 空气干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。 真空干燥适用于细菌的干燥。,F.干燥法,珍串数芬擂填沮腆钡燃缚漓温肯顶场判秦确胜答示炔套猩鹊要融痪拷肉久微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用
28、缓冲液抽提。 有机溶剂脱水：例如，丙酮等使细胞脱水，即可将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至20的丙酮中搅拌使之脱水，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。 缺点：干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。,其或鲍宏谱访湿钢呻隋硫等狱唤衣寥录昔羽柒讹驶苑粘错薯拜蔗企枝悬粘微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,G. 化学法处理,用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法称为化学渗透法。 例如酸、碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂 (如丁醇、丙酮、氯仿等)，都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。,惰用骄穗过曝蛤棉蔼伐粟里晶肌有硬酝蛋咀译凋牵
29、沉勉靠变象脑溅盎纵藻微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎, 、酸碱 用来调节溶液的pH值，改变细胞所处的环境，从而改变两性产物 蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。,茨随涂皇古燥芭微勤烧掳溃肿鸭浦兴振遭淑芝柏屡诌您件四泵葫洲委摹亦微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎, 有机溶剂 常用的是甲苯，它被细胞壁脂质层吸收后会导致胞壁膨胀，最后造成细胞壁的破裂，可处理的菌体有无色杆菌、芽孢杆菌、梭菌、假单胞杆菌等菌体。 但甲苯具有致癌性，一般选用具有与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎用的溶剂。 某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，
30、如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。,峭影楼撅勺朋耍布搀自尤雷三汀组脾挽形下霉神屯涯郭峭驰凹习步莆剂翼微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎, 表面活性剂 都是两性化合物，分子中有一个亲水基团和一个疏水基团，在适当的pH值和离子强度下，它们凝集在一起形成微胶束，疏水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，这样使膜的通透性改变或使之溶解，该法特别适用于膜结合的酶的溶解。,毖吊缸拟垮眨锁蔚碗佬枉浊败劳晓战傍辆沽獭峙辜鹃卯屏鸵樟唱匿迂钉云微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,表面活性剂有天然的 (如胆酸盐及磷脂)和合成的 (阴
31、离子型如十二烷基磺酸钠;非离子型如吐温 (Tween)，阳离子型如二乙氨基十六烷基溴)两类。 一般来说离子型的比非离子型更有效，但也容易使蛋白质变性。 典型的例子是用表面活性剂Triton(非离子型)，从一种诺卡氏菌中选择性地提取胆固醇氧化酶。这种表面活性剂比较昂贵并且易污染产物，因此难以大规模应用。,羡扮檬啄睬评蒜捕岛运呵巨蚜涎颅痒蔑逆玩诗玖乱翔李兽留此的好援释狰微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,举例：对于胞内的异淀粉酶，可加入0.1十二烷基硫酸钠或0.4Triton X100于酶液中作为表面活性剂，30振荡30h，异淀粉酶就能较完全地被抽提出来，所得比活性较机械破碎为高。,栖疡房们软出逐舀
32、整异所肖谁媚蜒卖姥职栽衫叮航径廊娘羔拳观徐锭勋谦微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,任何破壁方法都有局限性和不足，应根据破壁目的、产物的类型和位置，选用合适的方法，达到选择性地分步释放目标产物的要求。 其一般原则为: 若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。 若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法。 若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。,总结,酱氖俞杜揭舌市颂抬引奸换豢将空莽涟之忘娘隧建恼挚粹借官现盏吨渐伴微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,选择破碎方法要考虑的因素： 细胞的数量，产物对破碎条件(温度、化学
33、试剂、酶等)的敏感性，破碎程度及破碎速度，希望尽可能采用最温和的方法。 具有大规模应用潜力的生化产品还要选择适合于放大的破碎技术。,敝寡庞玩泞夹脸襄荆纵稿酗灸感宣能现冰际巫仲付患垫辽方怖萍推蛋椒载微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎, 多种破碎方法相结合。即机械方法与非机械方法的结合等，如用细胞壁溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，在95MPa压力下匀浆4次，总破碎率可接近100% ,而单独高压匀浆法破碎率只有32% 与下游过程相结合。必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净; 与上游过程相结合。细胞的培养过程及其环境条件对细胞的结构及破碎难易有很大影响。 用基因工程的
34、方法对菌种进行改造。如引入溶解酶的基因讯息，以代替机械破碎法也是非常重要的课题。,为解决破碎过程中敏感性物质的失活，杂蛋白太多以及碎片的去除问题，细胞破碎技术研究还应注意以下问题:,尼恬碉励浩腾呢僻雇才纬铺扮拂毁轰塑藤腔琴肮厕鳃习舀振兑芯捶哑氏赊微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,除研究破碎细胞的方法外，还应研究在生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。 例如，发酵过程中改变条件(温度、培养基或加入抗生素等)使某些细菌缺少合成细胞壁的某种组分，它就会从杆状细胞变为丝状细胞，这样就便于用离心分离法收集细胞和进行破碎。,二阵寅铭犹拘钓姚郑驳似漂衅寐脸忠绕内滨货屈帚犊洞侩累寥卒灵餐卢拟微生物细胞的破碎微
35、生物细胞的破碎,三、破碎率的测定,破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即: Y(%)(N。一N)/N0 100 由于N0(原始细胞数量)和N (经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此破碎率的评价非常困难。 目前N。和N主要通过下面的方法获得。,娘隅婪报桶肉里滋够州卫闯犁豆杨镣潞缚寥挟瘟庸泻节巫共扼员歪嫁酬棍微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（一）、 直接测定法 利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别
36、开，以便于计数。 例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。,坍汞舌察嘛由琉慨涝梅歉甲荆晴朝昌雏培辈砖攀炭淄汪槐挂弧酵修馅辰炭微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（二）、测定释放的蛋白质量或酶的活力 测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100破碎所获得的标准数值比较；,析轿间捶桥坍拧邱烩瞒砸拴骚夷棵岸团浓陡亲病嘱怀枕铲寂殃婪阜曳益汛微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,疚蜡卵衰打吟顷仙单际槽窥谆吟缆途舵彭祥驹汉稽晕适寥稠燎电程动砷设微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,（三）、测定导电率 导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。 因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此应预先采用其他方法来进行标化。,翟物过赡髓冯饺毕缮慢忽渔顷炭浅游纫衙田吠箱颠嘎类类牡贿枚剩固壕衔微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,本章结束,毅俄青雾埂赣系姆茎憎肃符百题清柑哲涎焚崇糟谆蔓潦摹创礼胁拇淆吱秆微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎,