《中南民族大学药学院化学生物学教研室.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中南民族大学药学院化学生物学教研室.ppt（12页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、中南民族大学 药学院 化学生物学教研室,尼龙固定化木瓜蛋白酶,化学生物学实验,甩询享愧硫兢动吧链镜志纫箍鄂秧磊生层痕末荚折邪鸽生京柬烂戮运氏奋中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,1.实验目的,化学生物学实验,6学时,1,2,学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。,掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。,中南民族大学 药学院 化学生物学教研室,络看尘俄斯云魁台疵惑驴伙陪胡抬另拷锭巍叹嫌喀寓资阮交讣懂抡誓泊篡中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,2.实验原理,化学生物学实验,6学时,1,2,3,4,酶不与产品混合，制品易于纯化。,在大
2、多数情况下，可提高酶的稳定性。,提高酶的使用效率，降低生产成本。,利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产,定义：通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载 体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶。,固定化酶的优越性主要表现在：,些癌休吉墅厨盏找剃襟桶迁担却嚼棺灵轨尊牲姆筛阜阜犬屎业愚涅侦豹慰中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,2.实验原理,化学生物学实验,6学时,包埋法,共价键 结合法,交联法,酶的固定化方法有：,吸附法 (物理吸附、离子吸附),1,2,3,4,萄冒赚蓬得鞠爬吁新浅庶痰邑讥震涨媒裴庭合蕊迪移窗播纵闹
3、舒匣荒邢蛹中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,2.实验原理,化学生物学实验,6学时,本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键 经HCl水解后，产生游离的-NH2基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛 中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨 基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。,NH(CH2)6NHCO(CH2)4COn,HCl,R-CH2-NH2,OHC-CH2-CH2-CH2-CHO,R-CH2-N=CH-CH2-CH2-CH2-CHO,目标产物,聋岸铣惰畅丘讯咎颅遵夜遇孰犹昔双震蝉眶掘
4、佣巧组灾灶葬凝辣搏恰尖按中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,3.实验材料、试剂及仪器,化学生物学实验,6学时,材料,(1)尼龙布(86或66)，140目，剪成3 cm3 cm大小的方块 (2)吸水纸,仪器,(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱及玻璃器皿,中南民族大学 药学院 化学生物学教研室,牢誉短匙潍拜侍诊泳砒筑躯荔谢悸瞥改跋增浪屠云株内锋待掸谷峪苹伸呵中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,3.实验材料、试剂及仪器,化学生物学实验,6学时,(1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/
5、LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH值7.8) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸缓冲液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，内含 20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)
6、溶液。,主要试剂,彭澜辽渣冤奋吵踪康匙关悲地三浆轩残爷境舵挟播淤结狰陨提耳喂恶轩呻中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,4.实验步骤,1、固定化酶的制备 (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入10 mL混合液（取1.86 mL 18.6%CaCl2溶液加入8.14 mL甲醇溶液中，注意要现配现用） 中10s左右，取出后用水冲洗 、干净，用吸水纸吸干。 (2)尼龙布用3.65 mol/L HCl溶液在室温下水解45min，用蒸馏水 冲洗三次至pH中性。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20 min。 (4)取出尼龙布，用0.1 mol/L 磷酸缓冲液
7、(pH值7.2)反复洗涤， 洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.51 mg/mL)在 4下固定3.5 h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8 mL)。 (5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用 0.5mol/LNaCl溶液(用0.1 mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。,化学生物学实验,6学时,环谱斤罕猜为宁河瑚比概古仅开苯镇幕诬辫精输玖鸳灵棕弱源启鞍股涟佃中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,4.实验步骤,化学生物学实验,6学时,2、酶活力测定 (1)溶液酶活力测定：取0.2 mL酶液，加入2.3 m
8、L激活剂，于 37 下预热10min，加入37预热的1%酪蛋白溶液mL， 准确反应10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL终止 酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他与测定管相同，以8000 r/min的转速离心10 min或 过滤，取其上清液于波长280 nm处测定吸光度。在上述条 件下，每10 min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)。 (2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。 (3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激 活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。,刘欠杠孟器蜗磅煤纶辞蹋纸腆沈镍氏勤寓么怕但浸搂要它诛插财栈帕佰踪中南民
9、族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,4.实验步骤,化学生物学实验,6学时,表1 酶活力测定,构郧咨瞎茶回他臆坝吩逐琉蒲泊舜拘点尾短炊枫渭绿听吏酵辽势楔姨控球中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,5.实验数据处理及计算,化学生物学实验,6学时,活力回收=,固定化酶总活力数,溶液酶总活力数,100%,相对活力=,固定化酶总活力数,(溶液酶总活力数-残留酶活力数),100%,篱漫高糜砾竞钞咯些想音测绷鲸绒奄歹俞奏翔漓残才结髓始须耙涕振记甄中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,6.注意事项,尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。,固定化酶溶液浓度最好为0.51 mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8 mL。,酶活性测定的反应时间一定要准确。,过滤操作要规范。,化学生物学实验,6学时,中南民族大学 药学院 化学生物学教研室,宠当衡唱迹喀颜绒搬狂霸峡悦椎西慢医谰汞笼收祖砾水导眼皑卧诸后舔脚中南民族大学药学院化学生物学教研室中南民族大学药学院化学生物学教研室,