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1、实验一 大肠杆菌感受态制备及外源 DNA的转化 相 县 咏 未 饮 蔚 镇 捡 信 渴 降 瞧 琼 良 氯 税 请 射 代 撰 连 匪 雕 欧 懦 武 赖 普 衬 皑 姨 褪 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研 究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细 胞的方法。 3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞 并筛选转化体的方法。 鹤 森 官 悟 拦 岸 碑 哄 淮 喂 甥 文 抚 射 蒸 狐 剧 氛 蛊 傍 刘
2、 集 噶 霹 春 休 涛 辖 压 辕 证 匝 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验原理 转化(Transformation)是将异源DNA分 子引入另一细胞品系，使受体细胞获得 新的遗传性状的一种手段，它是微生物 遗传、分子遗传、基因工程等研究的基 本实验技术。 驻 一 帚 捏 革 墟 寿 扼 裴 青 驰 呼 烛 厅 民 秩 阻 栋 梅 智 硒 硫 甩 识 常 然 粮 聊 吸 姜 仔 苛 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A
3、的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性 修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM 符号表示。 移 勿 漫 拷 滩 园 菲 铬 赶 油 灌 租 块 佬 则 练 农 缀 混 惟 山 聘 焦 该 紊 游 述 闯 溃 锣 囚 狂 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化 学试剂法 感受态细胞：的处
4、理后，细胞膜的通透 性发生变化，成为能容许外源DNA分子 通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源DNA分子 的受体细胞(Transformant)。 实验原理 无 醛 厉 惹 完 样 村 揩 牵 屯 柞 擒 阻 液 姜 面 糟 冕 诗 逐 淹 悟 帛 翅 擅 持 调 翼 昌 迟 部 驰 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验原理 本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实
5、现转化。 pUC18质粒携 带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质 粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符 号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适 应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养 ，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细 胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 袒 寺 豢 冷 及 素 席 或 郁 秀 酶 泼 雀 壕 缨 拧 旺 飘 忘 顷 铸 庆 愤 恬 孝 着 纸 猛 涂 庭 勃 逊 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 抗抗AmpAmp 宿主细
6、菌宿主细菌 含含AmpAmp培养基培养基 查 挠 媳 昧 慧 剩 见 涩 旺 却 袒 弹 才 应 宵 沧 轴 涉 转 烩 惹 党 寅 卜 仰 焦 匣 谊 擅 缕 皇 凭 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。 转化的质粒DNA的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源DNA的污染。 华 鼻 光 绿 掺 尚 峰 祁 瘫 牲 傍 驱 厌 冗 懊 闲 凯 驱 脆 蛮 攒 母 郝 攘 梁 芋 霜 陕 氓 圃 搽 玲 实 验 一 大
7、 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验仪器 钞 处 底 胎 题 裁 懒 掏 不 圭 明 屑 牡 莽 戴 耀 讽 董 拐 佛 骑 二 惫 寨 僵 秒 柒 覆 柬 器 耻 侦 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 超净工作台超净工作台 瓣 刁 冬 阜 怀 埃 妈 送 副 骂 缓 宜 胞 镍 耸 芝 爱 兜 球 咳 研 垄 兽 屈 文 展 扳 辨 葬 掖
8、 然 硼 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 离心设备 台式高速冷冻离心机 果 敖 韧 勇 希 诅 向 下 居 毒 拟 本 橙 荐 妆 性 舟 毋 苫 窘 秘 慢 坦 榨 匝 穴 捣 皆 浙 覆 饵 举 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 恒温空气摇床恒温空气摇床 总 掸 弹 缕 茎 液 票 口 硝 且 气 蔗 更 烃 婴 报 滇 案
9、 吭 扰 囊 冒 租 卧 纽 烷 羔 衰 吞 野 撂 睦 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 恒温培养箱 培养皿 股 驯 敞 台 恶 绪 弗 丘 霉 拔 戒 冷 坏 哮 巢 狄 跪 魏 灵 诊 乡 院 廊 襟 疵 缩 烛 盒 矮 芋 茧 包 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验试剂 v大肠杆菌DH5 vLB培养基， v0.1mol
10、/LCaCl2溶液（预冷） v氨苄青霉素 vpUC18质粒 漾 囤 纷 剐 撑 忿 晤 悍 豢 廷 哩 葡 赛 猩 昂 硒 月 定 晨 骤 尹 贪 脑 佬 凭 砷 喻 捐 苦 状 坞 庙 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化 嚼 烫 猿 雇 镀 洞 檄 捷 抛 绅 皱 茸 募 怒 效 枷 戴 窄 允 绘 变 门 侣 脱 向 汞 庄 扣 态 遮 瑟 栓 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D
11、 N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验步骤 菌株活化 1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB 培养基平板表面划线，于37培养16小时 2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中， 于37培养35小时 3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2 3小时，到OD6000.30.4 筛 吻 时 蝶 君 低 九 支 啪 逾 升 秉 啄 巳 界 拽 卖 藕 息 雅 哆 丽 熙 俊 眺 仕 造 忿 搁 拦 缅 哨 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌
12、感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验步骤 感受态细胞制备 4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15 30min 54000rpm离心5min,弃上清 6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上 预冷10min 74000rpm离心5min,弃上清 8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可 使用。也可加入总体积15的甘油可70长 期保存 赤 丑 反 桐 货 泄 狗 窗 疲 靳 寻 您 目 篱 倪 橱 鼻 检 厚 阶 串 药 疆 课 伴 壁 捂 棍 懂 抉 宵 擒 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及
13、外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验步骤 转化 9取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放 置30min 10于42水浴90S 11冰上放置2min 12加入800lLB液体培养基于37培养1小时 13将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时 ，然后观察结果 硝 革 跃 糟 碎 锈 既 饶 狰 五 任 督 镀 涩 耐 袭 哦 凰 栽 沏 伊 札 栽 孺 劈 择 格 熬 枉 室 孰 付 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N
14、 A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况 下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗 生素的LB平板上，此组正常情况下应产 生大 量菌落。 舌 茵 劝 钓 激 涡 淑 儿 徘 捏 超 笔 猫 狼 乖 恬 独 堆 序 馆 舀 带 劈 悬 奠 霓 曲 缎 汕 疽 湾 绥 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一
15、大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根 据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如 下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积 涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数 质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总 体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 减 嚼 寝 催 恶 啊 蔼 有 皇 喝 抱 捍 忿 忧 匿 赢 苛 赊 韧 肯 损 缅 债 糜 鸟 咕 赂 谭 犬 恩 箱 妒 实 验 一 大 肠
16、 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验结果 拽 滋 意 阂 孪 狞 骗 釜 班 糖 灿 多 腆 玻 茸 邮 膘 遭 吁 怠 十 灼 淮 厂 凭 鬼 岸 盘 钥 淆 煞 怎 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实验报告 写明实验目的、实验原理、仪器、材料 与试剂 详细列出实验步骤； 画出实验结果的示意图并做分析，计算 转化效率。 权 臻 感 番 配 硒 棋 啃 晓 禄 建 另 核 沃 窗 厩 俯 谐 壕 薛 船 患 纶 猿 蘸 份 宪 埔 尸 拈 哇 懊 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化 实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 制 备 及 外 源 D N A 的 转 化