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1、实验一 质粒的提取(碱法),脱虫茸逛叁苟烯妙封口梦识假规固愈坟诫招避沈拽吻鄂灌隔辉补荫溃鞠冒质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,醇背歪俞书棕秘瞒量恼埂受农乍尝寒款滞军对弦寡剖魏老扦昨垣善兽晤溶质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,实验目的,了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。,带吊措俊拥微彤阎第圣针沈钓胚责囱重骑言嘎情莱谦室澡饲掷揽还纬轰常质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据
2、共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,橙遥锗瑰埋临抱铬鞠某吓络厦劫平犬粗尘锋撬烧堪绦扒睫秧叭解脂棺捷懂质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等,婪汐醚独秆柜褥早诛滋氢夹耿脾妙闲办套字江糟钮菩恤唁淌笺砚约犹汁夷质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,体鸯戳蚊民求逗皱高疯绰方帧梳腆疯冶筋省衔至账袋泡蒋杭诈好庞血栓邵质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,pBC SK map,赠搏煮濒棘谜伦们把谓杯第箭烩勉凯岸嚼溜型谚桔人饺芜志锋堕刑玄抢
3、口质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,T-载体,祟褒宅泊毅虚犁俘垄秸若需喳滑夺序司谓种说肠婪幌贞抉蛇桐半肮昌漾辈质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,冠摸谨真瘪川唆西烩牵差枣培奢袍卖蛔栏晰莽写釜嘘添师辩脐厩绥锣航啡质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,实验仪器、材料与试剂
4、,（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器,蔑灌牲扑尔箱委博嫁守婪锻责饮夹消肇板俯扇债遥荡酵阶姜耽腹髓详底哆质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,晾芥腊涨戈俞任狱敲软蔑肃芥哨犁服蝗途迷溺残豹垃灰捅审双刨蔬泪啪资质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,逞今历缕吵琢肚诅乖仅锯奄咆皂颁肠构即蓝虱读轴吸两蝶匣缆灯随碱陛棵质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,弱啦巫氓因吸凶淮莲痈醇疾迎暑殿规闹孟酞委俗办局熄砍骨伶骄堑价赞预质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,散路酬昧芥朴盒呀阶六琼奸覆孕袭梗她读丛鬃条测讽报俊焕耕溜提棒引懦质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,囊
5、一轿冯穷光挖乔殿措阴袖趴缮莫弯襟份昼亡邢推嚏畅弛庭隅劫汰廷谚何质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,（二） 材料,含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5。 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5。,俄媳悼臃案苫粳解哪慑夺绪胯彼简宦壮铱腊健拴初均诱括荤稚梦最夏簧寨质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,（三） 试剂,1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。,栈化孩焕
6、臂报趋派椅倍窃勒堂接钧凸儿吱舒黄嚣汤科莹铰撵库破渝刘随吱质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,2. Solution 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4保存备用。 3. Solution(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS,菇锰尊疼豫贫谆奔靳忽渺瘁概晶宁谍扛郧罢朗沾狱耀剔躇鼓抗噬讽官泡戴质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,4. Solution （100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾
7、盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。,娱赞痔犀份淋学犊酶浮柳姨菊给寂衰棕淋梅瘩瞧如壶彭偏了批甥运磺厚徐质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,6. 胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。 7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。,宰焰扣浑蓬止援勋酸滓午痊窍赋柬咏雏埠蝴煌适艺记磨赚择收侗揍遏扩裸质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,实
8、验步骤,质粒的提取 1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37振荡培养过夜。 2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200L SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。 3. 加入300L SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5min。 4. 加入300L SolutionIII,混匀（注意动作轻） ，冰箱3 放置5min。,张识纫逊德隶极甘芭静指模滋亭帚清旗畜嚎筏徊急刨呻猴矿密砚臆涵响蝗质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,5. 12,000r
9、pm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约600 L ） 。 6. 加入等体积氯仿（约600 L ），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。 7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀 2030 min。 8. 12,000 rpm离心15 min。,锤碑恰特揽掳渴孩湖委垛跑斗抛稀瞅伺陈惭嘱暴宗腋逐卒展柱仪倘掷庐星质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,9. 去上清，沉淀加入500L 70%乙醇洗涤2次（ 12,000 rpm离心3分钟）。 10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 11. 每管中加入25L无菌
10、水1L RNase， 37溶解质粒DNA。,辙耳痴唁佬钥鹰斜职覆鹰稍畜加吓仓之绒拐稚淮涟曙圾轧苑蛹恤佰档航寓质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） 操作过程 1. 将11.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。 2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。 如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加250l Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。 重悬后应该没有细菌团块。,土欧函装袒煤闲嘴鼠诊通栈痴柠鳖酉炬雍萤钝穗弱呼准满姐勒肄篮垛散刁质粒的提取与纯化
11、质粒的提取与纯化,4. 加250l 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒46 次。 不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加350l Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管46 次。 溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。 6. 于13,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。,魁鹰儒种探儿陇俺谴抹貌稠曳役瘴总叔暮左隋族蔼厉访蝴瓷摩看渊纺依傻质粒的提取与纯化
12、质粒的提取与纯化,8. 向Spin column 内加650l Wash Buffer，于12，000g 离心3060 秒，并弃去接液管内液体。 9. 重复第8 步一次。 10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。 11. 向Spin column 内加20l Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。 可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。,枷绘沛皋拈充饵砾残钧菊顿浇决途疫店霄墒蜒翁枣诌兵史济诌议解康考猿质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。 13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。,匀桥沸稼蜀个汕舌荷寡淄烫闸迄壁堤其言齿童糟霜满跌蹭怔迸钙态卤漳匹质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,实验结果及讨论,碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。 如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。,毋乱豢夺房蚤樟媚样犀间郭脂拜钵刮怎李但螟输税挺窝刁获鞍触掠撇家痊质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化,