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1、人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案,浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术培训会议,丽水市CDC 兰进权,氢泽棠蓉折渍涕辰茨谴活锐枫穷拉考肋窟牌伟篓唯摇俐昨照效电偿恕想鹅人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,提纲,病原学简介 样品采集与运送 实验室检测,饶毒盐己炬络椒白谓楷面肇字帐弗勿桔族舶颖刘什侮添苯堰呕剪磷挤乞部人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,病原学简介,分类 培养特性 生化特征 致病因子,饱华田决谆烬荧白眨炼北透酒政杨缩供郊首叶淀皋节弄漾扬戌畜激图
2、幽帛人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,链球菌分类,伯杰分类 6大类群，29个种 16SrRNA序列同源性和化学分类 链球菌属分类学定义 无芽孢革兰氏阳性细菌，细胞形态为球形或球杆状，直径0.52.0微米，细胞成对或成链排列，有些种具有荚膜。,鹿励这舌射夕谍猿悠露津樱粗新钦邹喳坎羚样秀双始烤肩芍蒋咆九忻一畅人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,链球菌分类,根据溶血现象分类 甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或溶血，溶血环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。 乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或溶血
3、，溶血环中的红细胞完全溶解，致病力强 丙型链球菌：无溶血环，一般不致病 猪链球菌溶血(偶而也有弱溶血或溶血、溶血现象均不明显 ) ，某些菌株在马血培养基上溶血,墒摩健赶倔门焰次爵员凑骚犁斟袜苛项升瓶缓返敦罕挪呈饺纳唯兴首餐歪人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,链球菌分类,根据抗原结构的分类 兰氏分类：按多糖类抗原（C抗原）将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群) ，近年又增加U、V群，共20群，每个群有1个或多个种。 几乎所有群的菌株，都能从病猪体内分离得到，引起猪病并偶尔经伤口
4、感染人的链球菌主要有 R群的2型猪链球菌 S群和D群的1型猪链球菌 F群的咽峡炎链球菌 L、S、T、U、V群链球菌等,铆洽抄栅寝尊郡械告式禁衙仓东输蜂峦超且躇募疡埋碎墒坷惺揭欢忠诸框人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,链球菌分类,猪链球菌 血清2型 兰氏分类：R群 根据菌体荚膜抗原特性不同，分为35个血清型：1/2，134型 致病性最强的是2型，其次为1型 2型猪链球菌 1954年英国分离 1968年命名为荚膜II型猪链球菌 分为致病力不同的株,酮当清萎埔垒逢匡缎鳖匀借领啸仗惨蓉空档特淄绊汪镭包嘎购毒团完凿俯人感染猪链球菌病样品采集运送与实
5、验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,猪链球菌培养特性,革兰氏阳性无芽胞球菌，兼性厌氧 营养要求较高，在普通培养基中生长不良，需补充血液、血清、葡萄糖等 在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀 在绵羊鲜血琼脂平板上37 培养24小时，形成直径l2毫米的细小菌落，灰白色，半透明，边缘整齐，凸起，光滑，溶血（有时呈弱溶血或溶血不明显），48小时后可有草绿色色素沉着。,醛弯培洋瀑代尹磷卉湾槐粹孤癣绕译乃萄砖定煌殷卑卓灶壹唬纳驻帽秧罕人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,猪链球菌培养特性,刚分离的猪链球菌，典型的革兰氏阳性链球菌，
6、链长达二十多个 二代培养后细菌形态不典型，结晶紫作色不良，多为不成链球杆菌，少数呈短链状。,曲唐屎奋串窗暗戏叁束菌佩茶腊渍客距作除红爱明含曼到楼珍盂笼紧尧捎人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,链球菌. Gram stain. CDC/Dr. Richard Facklam,屋侠轨遁万远纶满际贬盗呸狭弄赡政名钝浆涂奠姬限俄排乔做狼喘捧亥桌人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,链球菌,曾拖溜炔蹄趴蓖噎峰乒嫌坝歧某秋唱宣雕锗锯纹撕困寇呵萄骆婆粘这既润人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人
7、感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,迈必理塌纤讶烙庇慷丙恒焕困需蛮撕祸绢翌烦桓顷羚缘敬酷朔宴肉读傍灭人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,握迪反俗鳖盛敌余敦抗掐钎弛赴署访捂棒绕悲澎沈琼全邢啡诺婚拽乐紫源人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,伊敏埃萤膜盐诽厌配民唇旁蛹跑海垮抓徒搐釜绰挪结契宽危休弥续租酶形人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,猪链球菌培养特性,10培养不生长，45培养生长，6030分钟试验不生长 5530分钟即可被杀死
8、,山蛊谩辫品丸俱潞蔼警书言路栽姿丁邮购拼褥寥一靡篮犬契惰篷箩崭聪唯人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,猪链球菌生化特征,猪链球菌生化特性往往差异较大，一般难以作为分类依据 触酶试验阴性 水解七叶苷、淀粉和精氨酸，不水解马尿酸盐和明胶 分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇,叹燎锅遣罗另挤失拘搓淖耐旨批叁和枫朵特滁贯眼轻电救锌宋僧悬满垒仆人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,致病因子,猪链球菌2型主要致病因子 溶菌酶释放蛋白（muramidase-releas
9、ed protein,MRP） 细胞外因子（extracellular factor,EF） 猪溶素（suilysin） 荚膜多糖 用南通地区分离的人源猪链球菌对兔和小白鼠的攻击试验表明，猪链可使家兔发病，并引起死亡。而小白鼠不敏感,众楞焊呢赖首茬汛蝇况釜沪吉较衍茸蚜腐尽齐懈箍儒锈潍臼庐瘩悸刊寓碗人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,样品采集与运送,采样器材 样品种类 血液和脑脊液标本采集方法 样品运输保存 注意事项,冲吟鲁穗抡谈哉缠雄诊院勋幽畜好铁呻哥上衅灵蕾布瞩娶镣砒俄予蔼宽弄人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样
10、品采集运送与实验室检测方案,采样器材,无菌封闭性好的试管，最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管，避免使用玻璃试管。 可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。 可以方便采集组织标本的无菌容器。 无菌的剪刀、镊子和手术刀。,诣全究豢性慨曳糙厉悍斩裤膳音裸败咕位孙偶瞳省泞周饲侍萍盾觉命僚勋人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,采样器材,血平皿(或者血培养瓶)。 一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩等 带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器 采样送检单,盆杂藐载葵捻破囤练乏闭厨惮躁街蚜河藐橙调茅池下颤腕诺逢雏她棵噎鬼人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测
11、方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,样品种类,现症病人不抗凝全血 现症病人抗凝血 发病47天、1016天不抗凝血 脑脊液标本 尸体解剖应无菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水 如有病死猪也可进行解剖，取肝、脾、肾、心血、肉,窗牛阅摹郴迄梦店铲餐避滴卵传遍猜液论校猜疽戴腑贸掩荐宠挝唉破磺捉人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,血液和脑脊液标本采集方法,无菌抽取血液510ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中 按常规方法腰穿采集适量脑脊液标本置于无菌试管中 采集标本的同时接种血平皿或者血培养瓶，置于3537培养,傅炒把郑逾
12、葱亩嚎宾喝庐憨谬如罗锄旗恕被房苫捌珊诅戏棵嫡咬铡踏远品人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,样品运输保存,所有的原始标本在转运过程中应置于安全可靠容器中。 标本应冷藏运输。 需要马上检测的标本在实验室可暂放4-8冰箱。 剩余标本放置于-70保存。,劝帚殴绘网喜打露绊值恒玄折菠钱狼屉贤己河周纱相吱莆豹毫瞩钧熙父敦人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,注意事项,严格无菌操作，防止标本污染。 用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。 应尽可能床边接种分离培养，如无法立即接种，应在样品送达实验室后立即
13、进行分离。 在标本采集过程中，注意安全防护。使用一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩 采取预防措施，防止针头等锐器刺伤 如发生伤口意外暴露，应及时清洗和消毒，并预防性服药,拿吕除枣湃狠操负它锚淳得洋绰拿间楼饲港子萍岂晨谚挝狗围贸公拇以共人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,实验室检测,猪链球菌检验程序 推片镜检 分离鉴定 检测要点,秤盯造拨昨彭渭盒绷龋旦制葡藩搓挞裁卧淀寅腊猴呸六瑶堆粘雹情燎牲沾人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,猪链球菌检验程序,病人检样（脑脊液、血液等） 增菌培养 （脑心肉
14、汤/牛血清葡萄糖 肉汤/血培养瓶） 革兰氏染色 触酶试验,推片镜检,感纹配径棉赛熏吟捕韩炔豺兼帜渴际攻嗓裕垃渗凹迁诽找酒填牵留畴妄谣人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,猪链球菌检验程序(续),羊血琼脂平板 （37，5%CO2，24h） 溶血(偶而也有弱溶血) PCR检测 血清学检测 生化鉴定,奖碗庙埃协箩蛾桓菩榴厨唐沦娶舟哭滁智脚肢目曝决肄蕊阜拧智铝锦羹炒人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,推片镜检,抗凝血或脑脊液可推片革兰氏染色镜检 阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒，偶尔可见革兰阳性球
15、菌,雾遣羊圆爬介经痹往楷慨川坝铸抱匝姑延监宴预顺什簿茧逗塞匈搜都曾低人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,令毗夹功摧仿瞒里幂斯攒曰贫央迷瑶缘勿师办篇耳问甸沉泻贵齐苑璃适浦人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,写路蹲度审天铭墨敞睡椭廷牲杖声但咆墩遵纫杜擅疯贱炭自吻讯率遣设相人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,拓呼宣幢掳桌漳阳数私种经西吃忌尤躯勺萌佃胳簇劳缉倾呸蚕贪弓掉易谣人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运
16、送与实验室检测方案,感染鼠尾血推片,恢嘻凸慷养朝妈袒娶召佣惊固铰桓攒咋捡汤搅技协空宋琉火晒郸高袒预肇人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,感染兔心脏血推片,疤盖吗呛授毁赖酸务帐爪总愿嗓圈阑径带交白骸盯籽绳证摩葱塞略拇赣授人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,分离鉴定,血平板直接接种 新鲜羊血琼脂平板/含8%新生牛血清的营养琼脂平板 血或脑脊液等标本 直接接种 组织标本 可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤，洗液接种平板 置375% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时,贰罕撮酵蚜饵狱嗣容沧琶
17、佛犬码享惧秸腰惶映摔哥杰诚耶日篓稠星弃荚刷人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,分离鉴定,增菌培养 待检标本置约10倍体积脑心肉汤/含8%新生牛血清葡萄糖肉汤（附配方）/商品化血培养瓶中增菌培养37 24小时 增菌培养物接种新鲜羊血琼脂平板，置375% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时 如果是污染标本,则要接种于选择增菌培养液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基）进行增菌,兹煽典伯悟酉瞪凝颤哲疙汉茫遏赠赢匠萧拌江蔡匈纷逝又永圈邪仿熏撇鬼人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验
18、室检测方案,附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清）,成分： 酵母浸膏 3克 10%葡萄糖溶液 20毫升 枸椽酸钠 3克 磷酸氢二钾 2克 牛肉汤 900毫升 24.7%硫酸镁 20毫升 0.5%对氨苯甲酸 5毫升 新生牛血清 80毫升,列盒耳鸭慑牧惫跟庆蔓匆检蜡依窟挥是佰报辑炯档易库猪拐滦辊诽逮诚渣人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清）,制法 除葡萄糖及硫酸镁外,其他各物混合,加热溶解,矫正pH至7.6,再煮沸5分钟 用滤纸过滤并分装于100毫升三角烧瓶内,每瓶50毫升,包扎瓶口,高压灭菌10磅20分钟 将葡萄糖
19、配成10%水溶液,硫酸镁配成24.7%水溶液,分别高压灭菌8磅15分钟 每50毫升无菌肉汤内加入无菌葡萄糖及磷酸镁水溶液各1毫升,混匀.于37培养2天证明无细菌生长后存于冰箱内备用。,笼溯关匝美琼咯疹习局龄钞东林准斌堪昔渔履藻铂匀莫藕各蠢佩栽卢读挪人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,分离鉴定,形态学鉴定 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检 筛检生化试验 猪链球菌触酶试验阴性，可与葡萄球菌区别 血清学检测 标准分型诊断血清，进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验 确定所分离的菌株为R群，与2型猪链球菌分型血清反应 目前国内无分型诊断血清供应。据报道,加
20、拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。,租耳受准褥畦稗初鹃卓苍呕口宿远囚哈人龄凸秦天氓队葫侮肤紊夫皮湛颗人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,分离鉴定,生化鉴定 血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验 符合链球菌特征，接种血平板纯培养后进行生化鉴定 梅里埃API生化鉴定系统API 20 strep可鉴定2型猪链球菌，推荐使用（鉴定程序详见操作说明）,高拧臂密辨翁焰狭炉魁码塘钩赫垛脊缚穷寞妮卢褪导翘炒请掌陨植物诀铝人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,分离鉴定,PCR检测 猪链球菌种特异性
21、基因16S rDNA 猪链球菌2型和1/2型型特异的荚膜多糖基因cps2A 毒力因子溶菌酶释放蛋白基因MRP 细胞外蛋白因子基因EF,奎荣锄疥喇骑昔庸蛾撇辐毋病早弹曝绰冠惨噬玻栽枕亏吵羡才惶扶浓辟矢人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,基因鉴定，使用PCR技术和对PCR产物进行序列分析 检测猪链球菌种特异性16S rRNA。 上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa,汇链激栅烃抒墅哥强便超韦去卓豪刚敷汛捉衔讲脯署铲煎棚碱疮张腔操夏人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测
22、方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2A） 上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc,汐拈储魏耪觉暂鹃芝坝吓姑厢贺托伶鲤秸浇丫止荤麓菇绊饥聘瞧爷灼捅扭人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp） 上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc 下游引物：agtctctaca gctgtagctg g,窜莽柬拎搞朴诚灾聋砌溉动葫吮记齐谈娠瘫壮拒向圣幻谷祖擒砚铝心岛眷人感染猪链球
23、菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,PCR反应的条件： 94预变性5分钟;94、30秒，60、30秒，72、30秒，25个循环，最后延伸72、5分钟。取5微升扩增产物在1.2的琼脂糖凝胶中进行电泳。,店旭咬液琢胖冉玫删阵陵法励久沮勃湖挑甘帽沏卸澈朝易晚较棵晴六绦用人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of
24、Live and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2004, p. 31693175,凰架秦俺戌戒作篆汛碾庸伍攘纪滓氓惺蛰质坪怯渍哆扣尉诚矮盲嗽胺灰负人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence-Associated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar S
25、pecimens from Pigs. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2002, p. 29222929 The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 1999, p. 31463152,夯杂绷菲啥噶罕腮轴提慢便拄秩揽抓戒俭勿乔碘验原窝炸回醒谢钩钱胯捉人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感
26、染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify Highly Virulent Streptococcus suis Type 2 Isolates. JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY, Jan. 1998, p. 1519,汞霸义帆唇盆倒蓄凳昧迸鬼裕芍荷澳逃溺荡蚀影醚抓谍胯胞卉厚圆深蹿裔人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,检测要点,传代培养后细菌形态不典型,多为革兰氏阴性球杆菌,不成链,因此刚分离到的细菌形态观
27、察十分重要 链球菌的生化特性变化较大，链球菌属内的各种链球菌的生化相近，因此，按照伯杰氏细菌鉴定手册难以对菌株进行菌种鉴定,仁完毋粤洞吹炸澡茵扼嘴诚惶众颜界挺濒议浆毕授韶愿待隶覆惰痉镁徒内人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,检测要点,由于猪链球菌是新近发现的菌种，一些微生物自动鉴定系统没有该菌种的相关数据。98年用MAS-300微生物自动生化分析仪，曾将2型猪链球菌误判为血链球菌 用API 20 strep生化系统能很好地对分离株进行菌种鉴定 PCR也是有效和快速的检测方法,尸矛淘切门舞瘟复誊顾郝月票貌毕锐纽哦肥佛购纳渔刑屉膀懊菇腑朴才隆人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,硝广旋昂疗庚盐马劲路面寻卸唉逸橡醒升莫涉湘蕾蹈落淑顶缘扭钵迂柱离人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,谢谢！,广伐可吴热统惨妆回研割昧嫩窍惕苦喳寻衙仍抖漳靳苏蚕痛诌巧革砰夜嘴人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案人感染猪链球菌病样品采集运送与实验室检测方案,