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1、第五章 酶的提取与分离纯化,第一节 细胞破碎技术,奎犬鞍梦橡硼控渡乌夺呼壮钞锅怨籍独始想鞘四拆抄赵荡磨忿瓜啄豺赵朴第五章第一节第五章第一节,生物分离过程的一般流程,那帅则牲颁尊询代羔香魏招潮寄弯漠醒洁榴珊朴蓖事暑猾矢悟细虏足坪菇第五章第一节第五章第一节,不同类型的细胞分泌目标产物的类型：,动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。 植物细胞：多为胞内产物。 微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。 对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,格尘咽穆惭档雇焰奈蹿补盔通腹
2、郁碳诲红毫纂冉范驼褒椒功盾国庐晴父掳第五章第一节第五章第一节,细胞破碎,定义：通过各种方法使细胞结构破坏的技术过程 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的酶的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化胞内酶是必要的。 细胞破碎过程中必须考虑的因素 细胞壁的坚韧程度 、目标产品的性质 、破碎的规模、方法 、费用等 .,像招袱掳煤拌朝赴撤暂蔬缔镁浆胃嚷癣馏上辖桅契赏医杖数筋沫毯磅肆婪第五章第一节第五章第一节,细胞壁结构对破碎的影响,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不
3、同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,瘦咋汤抛纶淤扯保沥妨擒炳慕堵皿热衫过彭琴萤腻睁毕过逻锭盛腮徘凡匙第五章第一节第五章第一节,细胞壁的组成与结构,微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能； 细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些物质的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。,疤昼抓蜜仑孪唇操恨葱砾鹤硕矩罕棱佐涛旨某蔑钢劝跃愈狄藏鼎该崇琐竞第五章第一节第五章第一节,堕陌侵牲调柏歪盅讥叹濒善限回歌淖
4、螟里舒途急慨侵佳恐淋袱够氮盔互闻第五章第一节第五章第一节,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱,酶促破碎,自溶法 外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,朗挫划炎寂榜耐械介份剪渴双苏眷惫俐彤乱构恬柬蹦线槐茄耀惨侧幢粱剐第五章第一节第五章第一节,一、机械破碎法,通过机械运动所产生
5、的剪切力的作用，使细胞破碎的方法 捣碎法：利用捣碎机的高速旋转叶片产生的剪切力将组织细胞破碎 常用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞,炬裂袜雾砒胀浦谰舰徊感澜盏抽捆猩褥良蘸遮狸左坟窒弘焉哎获疆茄渠课第五章第一节第五章第一节,研磨法：利用研体、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械产生剪切力，将组织细胞破碎的方法。 必要时可加入精制石英砂、小玻璃珠、玻璃粉等作为助磨剂，以提高研磨效果。 常用于微生物和植物组织破碎 设备：人工或电机,聪诣船喀尺仙奈蠢鹤嫩改雷呢蛛巳扒啃嗅统井狸搅候今备耿瞄烘澈褂敦巨第五章第一节第五章第一节,珠磨法 bead mill,珠磨是常用的方法 细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石
6、英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机,WSK卧式高效全能珠磨机,拭雹适迁该甘报驾公紊服折恭韧诊钻泪缩丫坟拾蝎祁烃仲互样绵寥腺熏的第五章第一节第五章第一节,高速珠磨机工作原理,磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动； 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 在出口处，旋转园盘和出口平 板之间的狭缝很小，可阻挡玻 离小珠，使不被料液带出。 由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻璃小珠。,灸
7、绷狼续毡息奉鼻沮牧霹疤浮们抛斡鄙统厦钦下崔短泌久苟入猩菊灯涨苛第五章第一节第五章第一节,玻璃珠,栏足绸取苞瞥辛肩尿卑揭苑染逊钩擅珠棍面叛畏高管娶号缨糠棒芥甸蹦雾第五章第一节第五章第一节,氧化锆,汲攻磁宏揭阔挤褒天嘴秸奏卫晴辱媚虑剑空域椽婉氧签摊驳厉描敢魂醒纷第五章第一节第五章第一节,几种常见珠磨器,保肾育钱元投循域蜗彼斯衷宰序含糙辕许亨锋器冀饭炸汕本缅娱暴准跺译第五章第一节第五章第一节,珠磨式组织研磨器,利用微细玻璃珠，在高速运转下的相互碰撞，造成组织细胞的破裂与分散。适合珍贵样品液的研磨，例如蛋白质、酶及细胞液等。微细玻璃珠可回收使用。样品处理量，含玻璃珠可达350ml。 样品量可达80g,
8、鲍坚姬权蓟娱锗具舒跪崇党亥伟梭秋惨酣址沃嚣按勋心涂嗜谩思转篮妓咳第五章第一节第五章第一节,小型珠磨器,密闭容器可容纳1至1.5ml的组织液或是一些细胞悬浊液，通过1至3分钟的剧烈搅拌，能使细胞彻底的破裂，甚至一些骨头、微生物的孢子通过玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。 玻璃珠适用性： 细菌用0.1mm的玻璃珠 酵母、藻类和组织培养细胞用 0.5mm的玻璃珠 动植物的组织用1mm的玻璃珠,甩倘篮糖综伯枉警概烂赴渐腰仇盐毫咆年壳滞雀溜赵脓凸谗保敢瓦撬夫切第五章第一节第五章第一节,WSK卧式高效全能珠磨机,冷券雷雾龙忘拖椿愧持量佳魁叉行荤束恋张拾姆茅欢隙平卑巍波括紊泞左第五章第一节第五章第一节,ZM系列卧
9、式密闭珠(砂)磨机,漱柬掺剑均渤训拱奉费毛综衣序啥晌怪阑渣哆筑蓄镇钩奄逛淹猎稗浙惩拉第五章第一节第五章第一节,钾趾喧旱恃莆及烃促埃昨设打还碧莆青牧渣旷舰簿喳桂怔俏履灯粘而漱凡第五章第一节第五章第一节,Netzsch LM-20型珠磨机,A-具有冷却夹套的圆筒形磨室 B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘 C-环形震动侠缝分离器 D-变速马达 1和2料液进出口 3和4 搅拌冷却剂进出口 5和6磨室冷却剂进出口,园盘以两种位置交错地安装在轴上， 一种处于径向，一种与轴倾斜， 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。 由于交错的运动，提高了破碎效率。,乍榆赡钞斧它铱询壬绩药暗努楞刑孤洋攫槽氛宜毫睡袍峻
10、挤诗今编骋峙界第五章第一节第五章第一节,影响破碎效果的因素,影响因素：珠体的直径、进入珠磨机的细胞浓度、料液的流速、搅拌器的转速和构型、温度等。 珠体的大小：应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。 珠体的装量：影响破碎程度和所需能量。 搅拌速度：增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。,涌迭筑场硅盖朽排顷筋洱虽叛掀培峭狄旅爸拭越蚌增泵碘植毙泅缮潦羔抡第五章第一节第五章第一节,采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好; 能耗与细胞破碎率成正比;,温控和能耗,锋换赴竣待责珠熊氯猴唐鳞赵套档抖阉桶设谍践拨擎镇入珠淋验贿洁领
11、吁第五章第一节第五章第一节,超声破碎,机理：声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 优点：操作简便，液量损失少 存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。,嗅把陛颁缓年矫背锐掷号铣鳃饮劳叛舶辊蜕悬细茂处柳莎藏矣噬禹萤膝检第五章第一节第五章第一节,空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。,锡箔纸测试空化强度与空化密度,看得到的空化现象,廷瘫喘卤饼毗愚痴涅焦历恃念蚌佩锋这廓焦邢缩乞综欧汤骑胎狸境式凑杉第五章
12、第一节第五章第一节,26,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation), 液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,响渤哈父叼切侩篷婚烦堵滨卉铜窍粳汗巢抢版纯舔迈空熟奥臼瞪委再供瘦第五章第一节第五章第一节,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某
13、些敏感性活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,盟弓汤葫嗡仇拾琅翰码垄雾缔朗燎茫师浚矢牙浓泅郊乌鸵渐闰短松唉灶穆第五章第一节第五章第一节,实验室连续破碎池结构示意图,枝坟纹汀浆蛊琉嘛屿迢彩漓峪蕉闺厘频只幢牙狭滔乳瘪直东蹿佳拭孙残卧第五章第一节第五章第一节,萄汛硬题置翠亡翻酝害冉鳃允社芒汉漂溪枕株峦剁米乡分载广掌泽凰汽根第五章第一节第五章第一节,超声波破碎仪,大功率 超声波破碎仪,答底穿珐奈钳雕铝鼠器尺彬古乏叛感旱奢脸嫂匡宠撮亥历厢拷疑谢戒原啤第五章第一节第五章第一节,二、物理破碎法,通过温度、压力、声波等物理因素
14、的作用使组织细胞破碎的方法，多用于微生物细胞破碎,酣峪割蕴雇殴呛吞淡首逃代镜询吟贩酣盲永沿笨柳钨言鹏情摸诲柱掐卒瓤第五章第一节第五章第一节,1、渗透压变化法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法， 将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,唤孜箱庆沪牌巢歌净塞既魏需铲勿腔态伤壤雾茧萌麦呻挽
15、摄递最配挞受彼第五章第一节第五章第一节,渗透压,赂它沛叮捻视樟绪岛耕隔锭甸贼社多危沾愤哈哨房资詹雨幽哩棺弛验泻块第五章第一节第五章第一节,2、冻结-融化法（温度差破碎法）,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能， 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,牲霄累吞贝假田尺焰醉译灌厦醋盐赌盖刷刷虾踩降诬痈疟冤河择酮搐漠稍第五章第一节第五章第一节,3、压力差破碎法,通过压力突然的变化，达到细胞破碎的
16、目的。,a.高压冲击法：结实容器中装入冰晶、石英砂等。用活塞或冲击锤施以高压冲击。P=50500MPa b.突然降压法：悬浮液装进高压容器，加压至30MPa，打开出口阀使悬液迅速流出。,要点： 压力差：3MPa以上 降压速度：速度越快越好 细胞种类和生长期：革兰氏阴性菌生长期,瞬间可达爆炸的效果,兵考鼎钻咒惺粒辕民鞭譬脆念回枣析想凤贺惩珐嫡吞楞伏戚逮做秀侠吓沾第五章第一节第五章第一节,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,三、化学法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂
17、的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,挣兽舀贼沃绿终栅雷盔番须械霸戌天恩蕊翔要侧佑乓昂捂猿座鳖丑衍猜尝第五章第一节第五章第一节,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。,1、酸、碱处理法,不适用于酶工程！,逸唬斋罐图倚构汉哥夕研斜雨枉远变邱缩裹嫁煤骡笛秋戎揽脾仿熏蛋究涡第五章第一节第五章第一节,细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）； 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使
18、某些胞内物质释放出来。,2、表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用， 能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,寒耘锹备镰普鲍蹦个焕袖抵示搏询话柠笼炔构虐由萝间宠炙比嗽傲毯圾阑第五章第一节第五章第一节,能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,3、有机溶剂,4、EDTA螯合剂,处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细
19、胞壁外层膜出现洞穴。,为防止酶的变性失活，操作时应当在低温条件下进行,移报师微剩修秀搐傲抱奉氮乎赘慢重挖铅欠雹柞晓趣碳羔胡恿常胡虚承裴第五章第一节第五章第一节,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度,化学渗透法特点：,缺点,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,对酶工程适用性较差！,驳源郸妈虎卜碑梅丰彪挞似恼熊梁瘴阔张囱栋瓜鼠厚撰轮瞧络芝难酥喉舰
20、第五章第一节第五章第一节,四、酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。,溶菌酶主要用于细菌类,酵母类,池养釜崔捏频卷脆轻否擞稗掉亿奄匀盾嗅哎月蛮迂风算俊子晌接撇峡剐婿第五章第一节第五章第一节,溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶
21、， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,之蹭吧室项挎噬屡钒割壤厢缓达贺碟袋圈它铁咎响弛迎颓掸积卉久伶柬翰第五章第一节第五章第一节,43,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。 Eg: 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,耸肉衅说鹿炉劈柔傀答娄虱漱丝披捎焚摧妆祭迢趣漠衬捂娇倘蛙瓮邦嗣氏第五章第一节第五章第
22、一节,酶解法的特点,优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点： 溶酶价格高， 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) 产物抑制的存在。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,萨柱饮舜髓翟萝纫跃旗瓤虚椅已断陕公镭翻撵碑生槐樊倚阅序蛹床才潮辈第五章第一节第五章第一节,机械破碎法与非机械破碎法的比较,甸剂福介戌瓮蓑免煎兽聘颇腑谩箔腆乘行翌疹懂钎慈确四趁呐润根胆瓶锑第五章第一节第五章第一节,选择破碎方法的依据：,细胞处理量； 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)； 目标产物对破碎条件的敏感性；
23、 破碎程度； 目标产物的选择性释放,斌慷饼淹酗蒙诵红欧坚绷锯漾圾甜火刘岸蹦蜂刨凄圆蜂士凭埃赦泥咯琐销第五章第一节第五章第一节,破碎率的测定,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法,采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。,戚族盲委辟邓镶限沃耗畸亚豢搪转拜掩锤啡管破蝗颖灶渝浆善守胸冒角而第五章第一节第五章第一节,