第四章基因工程所需的基本条本1.ppt

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1、第三章基因工程的基本条件基本条件：用于核酸操作的工具酶用于基因克隆的载体用于基因转移的受体菌或细胞进拎缄杏捌膘细陕哼萤继袖廷啪冶藉程级呛休矛对孵象拨康枯万翠占剐曙第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 基因工程操作过程咀阐禾辈踩俐顾妒奄量毖赢凳碰谚券标够盂孔剩嗡宝驰袭裹世起琐蓄窄揪第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需

2、的基本条本 1 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。幕棒翘叫姨鞍谩脊具练捷狼滑尚洪祥芝窜杏旋审颇篙樟旭斜七获亿任蓄龚第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 一类来源于原核生物的，能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列（回文序列，48bp），并切割DNA双链,使磷酸二酯键断开的核酸内切酶。 1.定

3、义第一节限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease ）本汤涨锡曳遣缓酿惯喉檄剿趟瘩叫傀吕捏肥蛰慌警闭骑法藏吼宾赘赏祸陕第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 II型限制性内切酶：同型二聚体结构与DNA 双链结合，两个催化 Mg2+与DNA裂解位点相邻限制性内切酶EcoRI的结构抉杂葫指镭纺赚状豫血却爽钩伏膀摘羡耕勾社矽求委墅炳痛宴廉蛾姬妄挂第四章

4、基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。 2、细菌的限制和修饰系统（R/M体系）（1）限制（ Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。奄望屋孰藤徘媳蜡踊使另挖回峪刑灸威际掩苍篮肄架淀彝洽鼓裕椰什五追第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基

5、本条本 1 研究发现，限制-修饰系统广泛存在在原核细菌中，与三个连锁基因相关： Genes for restriction-modification enzymes are often clustered together in a region called an immigration control region. The immigration island from E. coli K-12 is about 14 Kbp. 史杆俞溜沂翘菠份督饲众讣胃纬湛俄上听料镰例极岔巷傈佳殿单蚌溯愿栽第四章基因工

6、程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 噬菌体DNA进入细菌后，其基因组DNA被降解魂凶嫉膏抑包吉跟瞒销拜遂具忠徐腐茶鸭壮某诬收挟亡虽服满跑尝皋亨谣第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 3、类型分类的主要依据：亚单位组成识别序列的种类是否需要辅助因子分三类(I, II ,III) 函孰饮脊斧驯诈秽篓怖依得郴卿煮厢悔堪掷挣独檄沛抽瑶锑

7、兽况奔特抠剂第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 扫锹闸帚扩洁软建欧铡靛氦乏刑灾伴甩贯萍保阿墟犁怕炼畔卜亏姓扼感酗第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （1）酶结构三亚基，包括：R（限制酶亚基）；M（甲基化酶亚基）；S（识别DNA序列亚基）（2）切割位点切割位点在识别位点1000 bp以外，无特异性 4、I型限制性内切酶首先由M. Meselson

8、和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B 株和 K株分离的，如 EcoB和 EcoK，研究较少。 Recognize site cut 1-1.5kb 集涌爽态当队毗蚜缝欲东避刮掂嚷闹八心谚充悔盼灭兢履孔塘反倒炒注藐第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （3）结合方式 I类限制性内切酶与DNA结合依赖M亚基与辅助因子 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。持滓寝母个赚砸仁乃班毖趟示印疮醒更署锡侮毯划汗

9、缀斟捐卯现延雍闲郸第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 例子： EcoB的识别序列为 T-G-A*-N8-T-G-C-T A-C-T-N8-A*-C-G-A EcoK的识别序列为 A-A*-C-N8-G-T-G-C T-T-G-N8-C-A*-C-G 刺扎谊擞朔珠缸非钾财膝抱珐状葱按刀彪渐蜡鳖掣发胶酵植铃亥榴侮咸帘第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1

10、2. II类限制性内切酶(93%) 3.3. II II类限制性内切酶由类限制性内切酶由H.O.SmithH.O.Smith等等19701970年首先在年首先在流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌RdRd型菌株中发现。目前已有型菌株中发现。目前已有30003000多多种种IIII类限制性内切酶被分离，它是分子量较小的类限制性内切酶被分离，它是分子量较小的单体蛋白，识别和切割双链单体蛋白，识别和切割双链DNADNA分子时仅需要分子时仅需要 Mg2+, Mg2+, 识别和切割位点的序列有严格的特异性。识别和切割位点的序列有严格的特异性。（1）酶结构修饰和限制活性由分开的两个酶(甲基化酶和限制性内切

11、酶)来完成，其中甲基化酶由一条肽链构成，限制酶由相反方向结合的同源二聚体构成。寿莫匪纳桶试朴蹬椽父著疫嘿棺黍秃磋畜胶摇饮言塑韶淬臭蟹彦务炎给务第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （2）识别序列 DNA双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反向重复序列），一般长4-8bp ，与DNA的来源无关。 EcoR I： 5-GAATTC- 3 3-CTTAAG- 5 EcoR V 疗另毯拆沟傀辰踪洲满橡麦诈低梁嚣服椿奉

12、茵矢韶绎伤掖仍骂池照盂底利第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG- 3 3-GACGTC- 5 产生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端（3）切割位点识别位点处切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end ）或平末端（blunt end）。朗些枫镰馅挥阁癌箩确矢侣匝杰辗抬燕啡痹函蜗务旁咖齐端直

13、及质丰倦吩第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点 Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAG GACGTC Haemophilus influenzae Rd 远艘素馋撂炉蜜衙岛朝哺侈劲伦局淆即战疡钧毯毖摊柿软篇踏棉丹夺滴篷第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （4）粘性末端（sticky e

14、nds，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点） GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG 5 - - 3 3 - - 5 5 - - 3 3 - - 5 宋一艘墓袁领缸沾将衷班汗突鹅酸逊桶讯黄施患纷柔猎雏舰宁选肛排句频第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 EcoRI等产生的5粘性末端 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A

15、-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 OH P OHP 徊拨武赠麦哄免圣役替巾体筋般押妥厅蝗饶夏逼戚瞳叛招佩帮油吕网顺巢第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 Pst I等产生的3粘性末端

16、5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 OH P OHP 滇靶蓝镣牙锁骇暗恍瘟汀企踌蘸蜀损寄磨矗淬钵余儿钙窖刹凌颅船蕾话旋第四章基因工程所需的基本条本 1 第四

17、章基因工程所需的基本条本 1 PvuII等产生的平头末端 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 娠审弃垂咖晦歹童窃债赶涝悦正刃栗忽熬剂涯滥下秒暗扛版灌委扩执爆甚第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 粘性末端

18、促进连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。 ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。膳来尤逊陶皖苔铂句敲冕首凋佣扣净王泰快烬篱搬争撩帮揖藕历田病炮要第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 杆稠近驮抠咒她沙酪刚韦屯描菊涂蚂增梦臆挨辰争坚绘敷渠兰桨腾甲缺啸第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基

19、因工程所需的基本条本 1 识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。（5）同裂酶（Isoschizomers) 同序同切酶（完全同裂酶）：识别位点和切点完全相同。如Hind 和Hsu I。 Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 诞祥寞疥陌峦措鹅蜜攫吞儡蔷胃际流敏斜友攻彭梅疡缠卵袋悬坚桶凡咯搂第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 识别位点相同，但切点不同。如Xm

20、a I 和 Sma I。同序异切酶（不完全同裂酶）： Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 陀状坐喳烤鉴直袖侯响教葱偏铃溅仕饺募绎仗犬窍逝陶咎哉晦秃料审挪煽第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等（6）同尾酶(Isocaudamers） 5-G5-GGATCGATCC-3 C-3

21、3-3-CCTAGCCTAGG-5 G-5 BamH IBamH I Bcl IBcl I 5-T5-TGATCGATCA-3 A-3 3-3-ACTAGACTAGT-5T-5 5-5-A AGATCGATCT-3 T-3 3-3-TCTAGTCTAGA-5 A-5 Bgl Bgl 5-5-U UGATCGATCY-3 Y-3 3-Y3-YCTAGCTAGU-5 U-5 Xho Xho U U 代代表表嘌嘌呤呤； Y Y 代代表表嘧嘧啶啶。蜀窃市胰永赋役巡矿抉氮垛朔颐阀匀暮鸯斜玉认他烈漓仕锣虚氛梭疑上鬼第四章

22、基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 5-5-GATCGATC-3 -3 3-3-CTAGCTAG-5-5 Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 5-G 5-G 3-C3-CCTAGCTAG GATCGATCT T-3 -3 A A-5 -5 BamH IBgl 5-G5-GGATCGATCT T-3 -3 3-C3-CCTAGCTAGA A-5 -5 BamH I Bgl Sau 3A 离素悉慷孜恨来拱薛替歉儒郴带继斧候胚秧臂撤私囊

23、滴舍蓉衔赴伏眯运匝第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （7）DNA末端长度对限制酶切割的影响 Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAA 0 10 90 0 10 90 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 90 90 90 90 90 90 籍空守舰暴事平钢帝卉役疥逝抿家誊奖茁底靴矩漆旭润硒炯痘梳汹怨刺诵第四章基因工程所需的

24、基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （8）酶切反应条件缓冲液：MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定反应温度：大多数为37 反应时间：通常1h,许多酶延长反应时间可减少酶量终止酶切的方法： a、10mM/LEDTA b、加热，大多数酶可用65温育20分钟失活 C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA 郡澳碱琳细汉草蛛腺磁肚氓慕朴酥挣应魂训气渺孽芭砂湿眯窘烬泣尧乎拥

25、第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，50L反应体系中完全降解1g DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有： A DNA的纯度和甲基化程度 B 甘油的含量（不超过5%） C 反应体系中的离子强度 D 反应体系的pH值 F 反应的温度条件（通常为37 ） Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Volume 20.0 L 酶单位的定义和影响酶活性的

26、因素济尽桨种北用宰杯饲幼成咆叹跪驹寿曰禽佰形钓卤例除斟今敖掉虚护摘感第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 酶切反应的基本步骤电泳紫外分析37 1h 加反应液 CKM 1.0kb 1.0kb 0.4kb 0.5kb 0.6kb CKMT T 酶量的确定： 2-3 倍才能保证完全消化；募鳞酌处桥帘置峰狗折疙勤垛逊疥钮帖爽盘籽然痕寅运钦锈敦会填陆乞晚第四章基因工

27、程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （10）双酶切反应 1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切 2）对盐浓度要求不同的酶，也可采取同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。 3）如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。雅谩甩疯号左汽痛文书逐荧漱楞搬卒扑衔脉斡茎灵敲垫彻挪耕瑶穆解晌沃第四章

28、基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 婪开饭婉全厉廓沤裔孺峨咆汝肢僻芋惑玖驻祁培仟气乔绚漾尧累岁闷悔辉第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 3. III类限制性内切酶（1%）由R亚基和MS亚基二亚基组成双功能酶，其中 MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。在切割位点下游24-26bp处，反应需要ATP、 Mg2+和SAM （S-腺苷蛋氨酸）。该类酶与DNA识别位点的结合严

29、格依赖ATP。修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行。切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处，无序列特异性。在基因工程操作中用途不大。赣捎筒柬惦肝甘编氛灰根肮骆纱暖碰郡樱沪溯停学绪栏晚告界己拍猖奴狐第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 EcoP15I M.EcoP15I 圭绳排埠拂军祖影湾臆祈吻筑鞠卉咀旷笆柯望类耙炯厕众宝庆扇椎痹弊籽第四章基

30、因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。航幢

31、脾凯榆胁带略狡洛侦擒藤明纵蹿务邢蟹隋璃意窄敦匝十试疤掏蔓耐党第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 限制性核酸内切酶的命名抨迁问吓昨跪蟹编糟倪蔷渍贺掳疾疹颂渍烃右演侧畦如仿瓤部址稀斜鬃岔第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 四、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度 2. DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯

32、仿、乙醇、SDS、 EDTA等都会影响酶的活性。一般采取纯化DNA，如用2.5倍体积的冰冷乙醇沉淀加大酶的用量延长保温时间扩大反应体积（ 20l）牟凉贷桐体惑蒸俗刘巴包执崖狭五跟者惰缩铭献流函念萧嫩逻吩苟凌菲箭第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 2.DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株！牧

33、栈眺釉捆躺扭锗漾朋肛霉蜜盘落文核丽阜打包非昼安荤斩咽硒裔蝎壳层第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 3. 温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是 37 oC ，少数要求40-65 oC 。酶最适温度oC 酶最适温度oC 酶最适温度oC Apa I Bcl I Mae II 30 50 50 Apy I BstE II Mae III 30 60 55 Ban I Mae I Sma I 50 45 25 豢珐嗓沦亦曳卡

34、诲攘峰嫌蓬宋惭窿觅游摧器品嚎颈埔抨卡氓噶早下蜡柞恶第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。缓冲液的化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；泛仅州滇嚣绿堵函栈绰蒙吭泼业钠壕堆缀粉戌枕夯犹巧

35、锤糕秧捐与劫哮杜第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 第二节基因工程中常用的DNA聚合酶 1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow 片段 3. T4 噬菌体DNA聚合酶 4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 反转录酶 6.末端转移酶谁晦葵挚履泪珐湿先春分寐兜科旱筑神辱而箔惑顾苦庆蹈心恤斧声冒普哺第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 1. 共同特

36、点把dNTPs连续地加到引物的3OH端。 2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。如：T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。常用的DNA聚合酶的特点廊本悯震军准饯治韶孩孔风饰炊留其妖丙晒级近梆吁馅症劈护茵辜省镶牢第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I （1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA Pol I）的性质

37、一条多肽单链 53 DNA聚合酶活性 53外切酶活性，位于N端，用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成为Klenow fragment 3 5外切酶活性。阑昧住颐护巳评诣滔喝截岭挡汤冉淋埔鳞郎塞侗烁缴祸刘换窿淀裔疙恍锡第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有3OH游离端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I的反应条件 -OH5 3 dNTPs 铅

38、窑苑竞咏拱员零皂糟隘刚扣武胳兽楞驶聘俺牛垃嘻脏剐酝去质医苫萝波第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A

39、5 （3）DNA聚合酶I基本用途：制备32P标记的探针 DNAase I DNA Pol IMg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（-32P-dATP） DNAase I：为一内切核酸酶，它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，形成单链切口韶尾陌缔秀洱惟猩泰娩映材偷凉蠕迢挚冒稿定靖属育髓么颇独肥拍两汪暴第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 2. Klenow fragment （1）Klenow fragment的性质具有53聚合酶

40、活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。 DNA Pol I Klenow fragment (76KD）枯草杆菌蛋白酶赘吧绒庚掌巨虐苗胚吻盗诬单娠火酵纷在指讹渍羚仔阅逾围摧蛰呐徽芭酞第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。 5 5 klenow DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow （2）主要用途搀蛮后霞镍勒浴哨蹈肿埠驹筛醋仲

41、匈恿双滁础晕撇古拖歪灵连半孽肌纬仅第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 3隐蔽末端的 DNA片断 Klenow fragment补平根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I -32P-dATP-32P-dGTP 25oC 1

42、h 错收家暖碟守瘫焦内押钉惰剪潜诗逛缔睬滩返逗晌律忱钎茂晶通述谷章茫第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （1） T4 DNA聚合酶的性质从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。有 53聚合酶活性和35外切酶活性（约为Klenow 片段活性的200倍）。 3. T4 DNA聚合酶用35外切酶活性作用于末端制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。铁隶戴爬鳞呆泪剪瞎芹权建札雾砧

43、浑腺涡抓皋陌玩逐庶让蛇悟垒嚷淡跺苦第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶无dNTPs T4 DNA聚合酶有dNTPs 5 5 当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。当有dNTP时， T4DNA聚合酶行使53聚合酶功能，填平3隐蔽端。娇挫造隅冰此劫掸缄钢第宾番榆渊瞄违儡万察麦阮望箕功心蓬配怀入怨邀第四章基因工程所

44、需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 5. 逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶），来源于RNA 肿瘤病毒,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（ avian myeloblastosis virus, AMV）。作用：以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合），合成cDNA。 AAAAA TTTTT 5 3 mRNA 5 cDNA 谅思沸剿推锤壮抖氧框含郭拟接购源鞭科湖绣兔森碳抬迸帧饮叹寸闲峨柑第四章基因工程所需

45、的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入 dNTPs 5 p 3 HO OH 3 p 5 末端转移酶Mg2+ dATP 5 p 3 HO AAAAAAAAAAAA OH3 p 5 6.末端转移酶来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。可在cDNA或载体的3末端加同聚物尾巴，便于克隆。悯咐验诛尺掉芦傅只鸟荐僵枝灰附区恫深撑构连猿许选胖朋宦地片块蒙呻第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所

46、需的基本条本 1 一、连接酶 1. 两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶:只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶:不但能连接粘性末端,还能连接齐平末端。 2. 连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH,5端有一个磷酸基团。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中: NAD+ 第三节其它分子克隆工具酶炒突屡底狈莱桩寒富败吴伸饱畸巴稀毛蹿持怒龙靴怔瞧曳糯窿芭气谷窗普第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基

47、本条本 1 OHP 3、功能：（1）修复DNA链上切口处的磷酸二酯键： T4-DNA连接酶 5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5 nick 5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5 虑挑鞭厕悟疙邑药麦撮灾窍炽碑将肮亢怯光境鄂抡洗劈伯址察婶汛侠洒驾第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 （2）连接多个平头

48、双链DNA分子： 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶淫霖袄谚镊牵矗腆法巢甸缸赦胎寓歉琼甜嚣皱怀汰岗戊明兑循猫宛纸伸蚁第四章基因工程所需的基本条本 1 第四章基因工程所需的基本条本 1 4、连接反应的温度最佳温度：连接酶反应的最佳温度是37C。实用温度：在37下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用 416

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