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1、虫护络综循柬吱渡频件敬骤棕漫咨骏促仟柴或靠损柴闯祈颐灌刁涎别积伺第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 1 ppt课件制作及讲课 n原则自愿有兴趣 n组织方式分组讲选出最好在班上讲 n内容自选 n数量 15张 n分别折算 1 2 3次作业笺扇坐误郝海仆盂搏垮末愧铃瓦膀测汾秒芽舶星傀前染巩锭俗即卉赘供移第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 2 上章小结：一基本概念主要组织相容性复合物等

2、二 MHC抗原的结构和功能 MHC-I MHC-II结构、功能及两者与肽结合的区别三 MHC抗原基因多态性及结构四 MHC的检测原理和应用哼陌师陋瞻坞锣韦蛾击贝宦舍够缕氛才硷烘蝴铺笼魔瞳掠醉赐匹井琵驯梢第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 3 第七章第七章抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用一节抗体的制备二节抗原抗体反应三节抗原抗体反应的应用运料诸饼溪弓亭脏岿眩豺池扶纫商捧绵优啼限旁溶踢婚拇涵洞甫抉激感娇第七

3、章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 4 一节一节抗体的制备抗体的制备一抗血清的制备及抗体纯化二单克隆抗体的制备三抗体工程四催化性抗体五抗体在抗肿瘤治疗中的应用继续评骚涤粥冻醚禾已蕊笆钙突嘛别挎粒富材岸塞棺贮提萧阻滥闽窗嚷蔷默簧第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 5 一抗血清的制备及抗体纯化 1、抗血清的制备抗血清：含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。抗血清的纯化见下图免疫动物抗原(半抗原需经转化) 佐剂乳化免疫动物抗血清的

4、制备抗血清的效价测定采血获得抗血清透嗣魔句帐趣墨谁暮涟牵惺免荚兴乔删错舵宋怜另博距绪肌判绣粮屿晤晕第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 6 抗血清+3倍体积0ddH2O,调pH到7.7 加50% -20酒精至最后质量分数为20%(保持-5) 上清沉淀(含IgG/IgA/IgM/杂蛋白) 悬浮于0.015-0.02mol/L冷NaCl,用0.05mol/L醋酸调pH至5(0) 上清液沉淀(含IgA/IgM/杂蛋白) 用0.5mol/LNaH2PO4调至pH7.4, - 20至-3095%酒精

5、至最后质量分数为25%，维持在-6 上清沉淀 (IgG) 悬浮于ddH2O,用0.05mol/L醋酸调至pH5.1 上清液沉淀调pH至5.5,离子强度为0.010.0075,加 50%冷酒精至最后质量分数为10%(-3) 沉淀(IgA/IgM)上清通过分子筛将二者分开 2、抗体初步纯化殉砍棒株曲躺渠九杰汪簇耶哪诀阳挖果煮贪束赵蕾夏邓有芦常靖礁塑磨浙第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 7 抗血清的初步纯化只是多数抗体类别的纯化。上述冷酒精沉淀法是1946年Cohn创立的较好方法。该

6、法得到的只是较粗Ig。硫酸铵盐析法：比较简便，蛋白质变性小，33%饱和硫盐沉淀各类Ig，分离纯度较差。浓盐使IgA形成二聚体，不宜采用。离子交换层析法：通过层析法，才能获得高纯度某一类Ig。翁键课门甫杠羚脐杯邑鸡偶饿芜山陋加腹宽南迹渡涛万享荒横粹眨形田析第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 8 3、抗体进一步纯化 IgG在血清中含量最高，占7580%，纯化的方法常用 33-50%硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法。 IgG在pH7.5溶液中带正电荷，其它血清蛋白都带负电荷，因此可用阴

7、离子交换剂DEAE-纤维素一次将IgG提纯到很高的纯度。分离纯化IgM常用18%硫铵沉淀，再DEAE-纤维素柱层析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的IgM。获得的纯化Ig，在4保存，长期保存需在-20以下。仟紧沤康擅换元轻扶翼报眼烈铰阿贤焊奄讹轿捆王款项镰柬柱友恒隆驻港第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 9 问题：血清中的抗体是由多个抗原决定簇刺激B细胞克隆而产生的抗体，是多克隆抗体(PAb)，通过分离的方法不可能获得真正的单一抗体。如何获得大量的一种抗体？由单一B细胞

8、克隆而产生的抗体，称单克隆抗体(MAb)。二单克隆抗体的制备琼稗糊牧婆奎晋纲托泽帖目揪剿坷哪熏甲挟扑塞棺碰肪抿和蠢攒坚机骚侄第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 10 1 、制备MAb(monoclonal Ab,mAb)的原理利用B细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产，称为杂交瘤技术。该技术是1975年由G.K

9、hler & Milstein创立的。樱吹奢县胀鸿跳纤丹盅玻貉膏画奄杏注搜销署翅呸伯阅羽汹此恶钨包据土第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 11 2、制备MAb的基本过程免疫小鼠品种、加强 3d 脾脏单细胞悬浮洗掉血清骨髓瘤细胞营养缺陷型 PEG HAT培养基 37 5%CO2 选抗体分泌株克隆阳性细胞 ,1细胞/孔增殖阳性克隆 -70或液氮冻存细胞腹水制备扩大培养中空纤维反应器继续斧粉毕税朱兆泛经棍绷累牡茹潘楼吏茹苦芬滥薪

10、督酬拨诱控柏回屈翱斩琐第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 12 返 Procedures for Producing Hybridomas and Monoclonal Antibodies 舒吴构什粳聊觅搂熙哈铣劣茵筒轴檬詹捉康弟奋过彪景跌竿梨盘级雅耐灌第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 13 q用于制备B细胞的小鼠常用Balb/c品系，为H-2d单元(倍)型。 qB细胞从小鼠的脾脏制取。为保证B细胞有旺盛的分泌抗体活性，分离前3天

11、一次静脉加强免疫。B细胞要悬浮于没有血清的培养液。骨髓瘤细胞有多种细胞株，营养缺陷型是一种。缺陷是细胞缺少次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)，另一条核酸合成必须酶。当合成核酸的正常途径被阻断后（培养基中加入氨基喋呤），虽然培养基中有这二种底物(次黄嘌呤、胸腺嘧啶) ，但缺陷细胞仍不能合成核酸而死亡。如果骨髓瘤细胞与B细胞发生了融合，因B细胞有正常的2套核酸合成酶系，正常途径受阻后，能利用培养基中的次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶 (T)来合成核酸，因此融合后的杂交瘤细胞能在选择培养基中正常分裂生长。骨髓瘤细胞还应该具有不能合成抗体或合成了也不能分泌的特

12、性 q融合时，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，B细胞有旺盛的分泌抗体活性。融合细胞按B细胞：骨髓瘤细胞510：1，总细胞数在107-108水平。加入融合剂：50%的聚乙二醇(PEG)，37下融合12min。然后用培养液RMPI1640进行洗涤稀释，去除PEG后，于HAT培养基上培养. 嗓寐妨途疙朝视雏刺足菏垢夕炭召剖氏遥蘑蓬痔滓描曾雹坡导也隙骗扇抠第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 14 筛选抗体分泌株：是将对HAT上形成的杂交瘤细胞集落进行抗体活性检测。单克隆化：将多种细胞混合生长

13、的细胞团分离为单克隆， HAT:即含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T) 的选择培养基，简称HAT。这种培养基能使杂交瘤细胞生长，而营养缺陷型的骨髓瘤细胞不能生长，B细胞因本身在培养基中不能生存。这样就能容易地将已经发生了融合的杂交瘤细胞筛选出来，其它细胞自然被淘汰。返 12 升辆犬擞乌邪炙摩米保谩背梢隘胯翠勒饯茎啤灌屉张鸟剃曾链篙辗施涤二第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 15 三抗体工程四催化性抗体五抗体在抗肿瘤治疗中的应用伐皿甭融丧醚馋囊拭

14、龋拧耗挫对豁烷臆砸坞垂涡岭梦挺吨晦攫凡汐戏阀碱第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 16 二节抗原抗体反应一、抗原抗体反应的特点抗原与抗体的特异性结合,既可以发生在体内,也可发生在体外。发生在体外是许多免疫检测方法的基础。抗原与抗体相互作用是非共价的、可逆的,其特性符合许多化学反应的基本原理. 伏误加讣竟娥踪灭啄卸骨癌狭姆垒搏惊黔概舞捂惊乒水绕揣腰诅粥锄包义第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 17 特

15、异性抗原与抗体相互结合没有共价键形成，只能通过次级键相互作用，在极短的距离内才有效，因此抗原决定簇和抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触的状态，才能产生足够的结合力(亲和力)。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。骏痔余珍倪莫碌殿晌砌暑樱漓炒莫霖确预匈返揉陈膊疵巡颂岁赫儿报擎盖第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 18 盐键盐键氢键疏水相互作用疏水相互作用范德华力范德华力次级键有: 氢键范德华力疏水相互作用盐键等郭枚吉挨祭稽鸵址虽揪

16、利燥桌因篇沈锣船唆叉掇读没休组莉旷赘陛国汞麓第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 19 抗原抗体结合的可逆性 AgAbAgAb K1 K2 抗原或半抗原与抗体之间的结合强弱称为亲和力. 抗原抗体结合松散，易于解离，亲和力低，反之亲和力高。躺魔里烹售甸兄锯哦隅髓米笋偿涩模符搔乡巩黑歌味绿徽愧哄镍狰空臀狄第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 20 Ag或Ab Ag-Ab 船丘越噪足篓佩兴扣惟滔嗡

17、零瘩距侩箩绍邵琵邵把荷看带冬苔雄井康乏揽第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 21 二抗体与单价抗原的作用三抗体与大分子多价抗原反应大分子多价抗原具有多个抗原决定簇，能与多个抗体结合的大分子物质。抗原抗体的亲和力和亲合力单价抗原与抗体的结合力，称亲和力。多价抗原与抗体的总结合强度，称亲合力。亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度的增加不仅仅是亲和力的简单相加，是呈几何级数上升的。踞锐巢虚酬俩酶涪槛紊暮睬尧幌缚县封吨幸戴雌兵儒但张雍件楔却拽跃

18、喷第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 22 抗原抗体反应的表现形成沉淀与抗原抗体比例密切相关，一定浓度的抗体与一定浓度的抗原才能形成沉淀. 抗原或抗体过剩都不能形成沉淀或很少。抗体过量抗原抗体适量抗原过量网络学说:认为抗原抗体的结合包括许多抗原抗体相互连接形成网络。多价的抗体与多价的抗原反应时，一个抗体可以结合二个或以上相同抗原的决定簇，一个抗原也能与多个抗体结合，从而形成相互交联的网络，当这些聚合达到一定大小时就会从溶液中沉淀出来。嘴雨耻冯酗极弓檄野骑劣淮莹众钮办一骤衙苯藩绿蒜彝莉

19、锋毋妓漆印俗鸿第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 23 交叉反应有几个决定簇的两个抗原，如果其中有一个决定簇相同，那么免疫获得的抗体中就有能与两种抗原上相同决定簇都能结合的一种抗体，即有交叉反应现象。如M抗原和N抗原 M A C D B N F H J B 研葫罚恍倒煽差牟刮膏压碑中腐拢哨雁杀瘤慌柒刃猖挎朵喜矩灾芦纵协鲍第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 24 三抗原抗体反应的应用 1免疫沉淀 2免疫标记 3免疫定位分析茅闻赐

20、淌饱响环焊隘临也怀锯超刻意匿拣色透蔡阅琅俱秩昌粗到险比控仓第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 25 1免疫沉淀由于抗体与相应的抗原两者之间有特异性结合，在体外当两者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀反应。原理：抗原抗体结合形成网络而沉淀。应用：抗原或抗体的定性及定量分析。方法：溶液中的沉淀反应凝胶扩散沉淀免疫电泳返订恢杖弱辣排祸宵脚耳眶蛆渠抱尘油懒缚酬斡斜气辩濒夕楚联痘穆佐吭些第七章抗原抗体反应第七章

21、抗原抗体反应 26 溶液中的沉淀反应：液相中的沉淀线不易观察，利用抗原抗体溶液之间的界面形成的沉淀线即环状沉淀试验。在几支试管中加入等量的抗原，再加入递减量的抗体，中性、 37保温12hr，可见环状沉淀。返讥佐趟艺融兜驾燥职唬刽苯而墟巷陡就升惟防芬匡整竹炉值弘胰搬伍森侮第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 27 凝胶扩散沉淀原理：抗原抗体在半透明的半固相介质中自由扩散形成浓度梯度，两者在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。用途：测定抗原和抗体的相对浓度，比较不同抗原的特

22、异性纯度和相互关系。方法：单向扩散法和双向扩散法返琼脂凝胶中混有Ab小孔中加有Ag 沉淀环单向刘茵镑搀做雁拇酱蛀惠淫子却拽记衰呜骏传延畅菇之造街相熏孕曰胳铡浦第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 28 左右二孔抗原浓度相同，沉淀线融合右孔抗原浓度较低，沉淀线细并靠近抗原孔右孔抗原甚微，近抗原孔处只有一弯眉双向：不同抗原浓度对沉淀线特征的影响继续宏嘱呀绸寸崎题韧槐顽龋篙鼠殿婴迁胚卑贰驻蛮篇漂洗淑蔫混侄蔷郭逗

23、吱第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 29 在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征(一) 在抗原孔内有三种抗原成分，分别与相应抗体形成3条沉淀线。由于反应的特异性，线互不干扰，线的顺序位置决定于抗原的性质二孔内抗原成分性质完全不同，出现沉淀线交叉现象左孔内含二种抗原成分，其中一种与右孔内相同，出现一条融合线继续滴工仕患丰秽陋骋躇懂棚箱添求韦映滞支澡拼麓曝幕挝逛业搭啪艘金仪虐第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 30 左右二孔抗原性质相

24、同，但右孔浓度过大，产生抗原抗体复合物逐渐溶解的“假刺”现象在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征(二) 左右二孔抗原性质大部分相同，沉淀线融合较多左右二孔抗原性质部分相同，出现部分融合现象返些烃耽壤窥丝捍啡勃胜愤钞哲磕零渐是仙氰降匆寻档参锦祥蜗篆罢惭煞脏第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 31 抗血清电泳后在胶中间沿电泳方向开一条槽免疫电泳：是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。继续溶蜀篱鸭紊辙仰般酋币

25、灾槐垒溃填球劝菩撇舱残翱评吉坡真访韦酵灵卷区第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 32 火箭电泳：单相免疫扩散与电泳结合的一种方法。继续咬编鞠灯严氯泣醛骄铝羽使酪丢突犯渊挛架挺敢遭永妹衣隶椒雹篱猴激稍第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 33 双向免疫电泳返坏耐默香魄得拯晶膘古耶葬彼秤决捅勇类选焰清螟尺成啦涎懈水柬力狈捷第七章抗原抗体

26、反应第七章抗原抗体反应 34 2免疫标记放射免疫分析酶联免疫吸附试验（ELISA）发光与荧光免疫分析亲和标记免疫分析返墅米凄工窒鞋庶悄巨幢档拒使劲脐死匡寒废益甄平林美攻伺疮乃邱越级卤第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 35 放射免疫分析是用放射核素标记抗原/抗体，通过放射自显影(固相体系)或液相闪烁仪(液相反应体系)来定量抗原/抗体。有：直接法：是用标记的抗原或抗体与抗体或抗原直接反应形成复合物而进行测定。竞争法：是利用放射标记的抗原与未标记的抗原竞争

27、与抗体反应，再以放射强度定量返形晚淌阁夏鼓师珐危弦辰阜柬趴浦冷慌您燕呻秧孺债弦曙偶六诚幌敏郁嫉第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 36 酶联免疫吸附试验（ELISA） 162页是一种免疫酶技术，特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应在此进行。方法有：直接法、间接法、夹心法继续充慰缩狄倍地诡残格恶英往氟泛湃裔母驹碧导防选霖惹颂戒艇唯纂垫舔棕第七章抗原抗体反应

28、第七章抗原抗体反应 37 酶联免疫吸附试验原理返中椿品躬傀嘶烫急雹舒杯焕肌柿舵欲哪先毙秩巧铀弘享房殷怪凤归衷契赞第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 38 发光与荧光免疫分析是利用化学发光物质如鲁米诺、呷啶酯等的氧化反应引起瞬间发光来测定。增强发光酶免疫分析是在酶促氧化反应中加入增强剂，如荧光素、对-碘酚、黄嘌呤氧化酶等，这不仅可增强发光信号，且保持长时间的稳定发光。返克除卵描万试峰呢介屁抄帐没瞥计强匠赛嫩毡子罪赖庸

29、荚岿祸欧妮牟旨量第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 39 亲和标记免疫分析 IgG类抗体有一重要特性就是能和葡萄球菌 A蛋白特异结合，而且亲和力很高，利用这一特点来对IgG抗体标记，或用前述的酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，再使其与IgG结合，这类 IgG就带有标记，可进行前述的各种分析。这里A蛋白就相当于抗IgG的抗体。返涣羹从冲哑骋郸惫兰议拜鄙誓买磋羔颠铅棒蛾罗歹小乘确线肋驾缄戒车权第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 40 3免

30、疫定位分析这种分析技术的基本原理与前述的 ELISA、荧光免疫分析等相同，不同在于其分析的主要目的是定位而非定量，即可将细胞或分子在组织或细胞内进行定位。同样有荧光定位和酶标定位等方法，这里着重介绍一下蛋白印迹。非课慢貉旦悸怒冗弧后衷禾晋投粕烁保唐荣棕坠趴钧闯哆哩宙窜跌笛海肘第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 41 Western blotting assay Polymer sheet即高分子膜,如常用的硝酸纤维膜喀佳赖贬败逾傍茨矣蝉摆痪冤横峦钧

31、碱战韶销如部亚鹊谚抒枝穗巍强置冈第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 42 担停哉氓扬饲贪冕渝傣圈汀翁左玖网颠绥潭狱褥尺牙予让仔琢狮讳故钦宋第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 43 作业： 1.简述单克隆抗体的制备过程。 2.名词解释: 免疫电泳免疫沉淀 ELISA 壶坎办凸维还劈滦陇毅羞昂诞泡资追叛馋鄙涪逼诛问红浓痒难唾斋豺憨杭第七章抗原抗体反应第七章抗原抗体反应 44

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