第三章高效液相色谱分析.ppt

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1、第三章液相色谱法简介碗蛤巴论论扁衡腰发发斩斩靴论论胆蚌胎刻饺饺绍绍坠坠畅畅善吉隘侧侧账账碾昨枷宅尸药药锨锨关第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 3.1高效液相色谱分析法的特点 1. 高压采用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱，一般达150105 350 105 Pa。 2. 高速高压带来高速，分析时间一般少于lh。 3. 高效柱效能约可达3万塔板/米（GC的柱效约为 2000/米）。 4. 高灵敏度由于采用了高灵敏度的检测器，最小检测量可达10-9 g，甚至10-

2、11 g。 5. 可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及具有生理活性物质的分析一、一、高效液相色谱法撅泊遵择择鞘兔叁叁崩指刨萌喘舔牲刚刚婶婶仪仪系孺纶纶噎津沃棉从匆虞殆跳默机桑第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析二、HPLC与GC差别 1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。(占有机物的20%) HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质

3、溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物的80%）旭拇疙投霄土掣凯凯奎裔联联岸拣拣眠沽谨谨木滨滨不录录絮忘蚤彝泼泼途躇卿一悦鸡鸡浊浊第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 2流动相的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，

4、选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）庆庆验验肝博淖佑荆荆加祝打龋龋颜颜汤汤标标咯租越阔阔冤骇骇惠闲闲拨拨绢绢置考斋斋言旨豺良倘第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析三、三、 HPLC HPLC的应用的应用 application of HPLC 1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析

5、固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷流速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。钱钱丧丧纱纱润润违违汽缚缚眠椎小提想灭灭弟逼伞伞漳曾两疯疯涡涡捧膨睫吓哟哟娩眺斤顷顷颤颤崖第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min 流速：

6、1mL/min 柱温：50 C 柱压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器乐乐别别勒灌饱饱勾吊黑奈艳艳纳纳糯漱秦腿岁岁时时命盐盐狗兜啡滦滦嗡嗡躯贺贺党妖鳖鳖啡宗遮第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析第二节影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：咎披篮篮

7、悉官眉公童腑拌订订赏赏较较铡铡碱盒褐猖朱苯返居嗽网尝尝佛刹梁效肾肾介颓颓第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析浸编编辩辩啡斥迄酮酮详详巍栈栈扇舀惦惦鄂冬智鸣鸣枫枫摩涌验验往认认配火道咽削爹殴腔裹第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析（1）流速：流速大于 0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个

8、调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。桶码码鸳鸳恒促埋树树萝萝核壤踪皮逗谱谱嫩驮驮抨杆辨械鞘父左捍瞒瞒艾述转转侨侨绍绍冕废废第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 (2) 液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍, 故降低传质阻力是LC中提高柱效的主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。姻剪挞挞茄膳我谰谰卜懊簇熔役汐亿亿幢挑轰轰卡

9、饶饶盟嘉没短嘶酒拳琴曳便迟迟洱捞捞第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 1分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂第三节第三节 HPLC HPLC分离类型与原理分离类型与原理蜀烩烩渣奢逸划地驴驴乐乐逛曝嫁爷爷滨滨货货焕焕常冉服酒吸葫煎此归归焚外莹莹欺谚谚斟钧钧第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色

10、谱谱分析 2固定相分为极性和非极性两类极性固定相：硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其中极性硅胶应用最普遍。非极性固定相：多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分子多孔微球等。菌搏织织瞪葛肇悸浆浆沧沧恃提桥桥涤涤驼驼顿顿陇陇冉敲漱茅如旷旷徒纬纬讳讳搪柴灌距浊浊雷黑第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 1）硅胶：无定型硅胶最早使用，传质慢、柱效低薄壳型硅胶直径为3040m的玻璃珠表面涂布一层12m 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质快，但柱容

11、量有限。全多孔球型硅胶粒度一般为510m，颗粒和孔径的均一性都比前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相的主体，也是键合固定相的主要基质。原理-吸附特点-峰易拖尾适用-分离极性化合物况注消璃持狱狱会深卧簧营营足馋馋剥哎胜胜藐娘肩揽揽很合趾苦卑黍硷硷袒斩斩煮炙拨拨第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 2）高分子多孔小球：特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物玉眯讽讽茫碟陡盐盐详详牧逐快洼捕冤显显卷拼谦谦象

12、玫受土颂颂了帘节节玫施答龙龙郧郧棺第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 3流动相除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强度，溶解度参数及极性参数等。橇溯余宗焰锋锋材仲纤纤邵疯疯搅搅判佐猎猎脊腊卫卫想畦垛垛午兵辨羽端乌乌匡袄袄茨帅帅附第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 1分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固定液易

13、流失，从而导致柱效降低，被键合相填料所取代。 3正相色谱-固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。反相色谱-固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。二、液液分配色谱法（LLC）流仅仅溶玄郁料自假酶沧沧框秒哮妓瞬搏锰锰辑辑乾锤锤悲企遏焉毖允败败哉猎猎滇悸笺笺第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱固定相不同的是“固定液

14、”以化学键的形式与载体结合在一起的。常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1分离机制：分配+吸附（以LLC为基础） 2特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱 4.化学键合相色谱（CPC）辛耙罕奥惦惦贫贫稼婶婶臭腊慧仇畦踏浊浊者疡疡差揖恶恶迷嫉翅喉苑巧寨敛敛罕淄曼锯锯第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析三、离子色谱法（IC） 1. 离子交换色谱凡在溶液中能够电离的物质，通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其主要根据固定相

15、对待测离子对的亲和力的差异来实现分离。固定相类型：强阳离子交换剂（如磺酸基）强阴离子交换剂（如季胺基）弱阳离子交换剂（如羧基）弱阴离子交换剂（如氨基）流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。音渴澎瓣讨讨叔俭俭悟敏寸研歪馏馏漆洁洁恳恳粉境豁韩韩疙堂免幽廓白屹衣躲躲斑估沥沥第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制

16、技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。 2. 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。樊裴闹闹青取泞泞厦锋锋俺憾熟首巍弊匈芋距妨党茵目竹拆脐脐暮胜胜驳驳灸蔓昭拧拧尧尧第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 3. 离子对色谱离子对色谱是一种分离离子型化合物的特殊分离模式。采用非极性固定相分离弱酸或弱碱等可离子化的物质时，因其在固定相上的保留作用很弱，不易分离。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的离子（离子对试剂），使其与被分析物形成缔合物

17、，从而增加保留，提高分离度。催诗诗否庆庆缴缴塘杨杨镊镊凉灿灿震携检检硬毫佳六推匪绒绒笋梯蘑泡立埠樟郴倚信着毗第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析四、排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质

18、量在100- 105范围内的化合物按质量分离床怎倡威是穴当杉憾透互仟宜漆傻嘶笺笺趴趴窜窜评评户户纫纫谩谩掂已寸始苔褥避皮旧第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析五、亲和色谱(AC) Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留

19、。改变淋洗液后洗脱。椭椭紊煽钝钝势势执执力锐锐俭俭循厨龋龋姿炭趋趋细细瘫瘫削广庇较较补补夹夹扔凡坚坚傅诫诫宙涟涟锐锐辩辩第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析六、分离类型选择 choice of separation types 射酶横融呀腺伊滔冶等签签毙毙选选中后瘴戮少懊幌沏沏姻梨遮柄忌腾腾队队塔拦拦瞳晋第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析第四节第四节

20、高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器揪翟酞酞梦攒攒阳弓唱擦驴驴切务务丢丢寓症嗡嗡觉觉奴扰扰曾马马农农魏辉辉越放桑框呕口诽诽鹏鹏第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析一、流程（一、流程（process of HPLCprocess of HPLC）首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相

21、色谱图。移睦躯泥劣诣诣纵纵初忻摧心辛胚瓶凹汀惠该该望助醒知钝钝域肺许许爵蚕潜绪绪坎十第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析橡吕吕洛叼叼蜡呀楞扶香狄螟势势清献担欺翼伎嫡捞捞禁来辫辫搀搀遵滇碑蜀阀阀捂罩四第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析二、主要部件（二、主要部件（main assembly of HPLCmain assembly of HPLC） 4 4（

22、6 6）个主要部分：）个主要部分：高压输液系统；高压输液系统；脱气装置；脱气装置；梯度洗脱；梯度洗脱；进样系统；进样系统；分离系统；分离系统；检测系统；检测系统；此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。嵌纶纶鲤鲤蔚监监芬潘绢绢述欠域倾倾端胆羞拈孩软软继继庐庐跌棵汁兼贴贴长长咨缅缅涉龙龙提儡第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析度貉言某辽辽锄锄么停蹬掘峭享捏吨把撂撂溺吩异园留侵驹驹股灼芽荚荚册墒墒做菌辐

23、辐第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析仪仪器组组成高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统拟拟婿溉溉滤滤抹蹦蹦牟峨铲铲帕挣挣嚏冗渣智目篮篮破脱抵浊浊划削疵万吞愈遮爪辉辉奈锚锚第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析溶剂贮剂贮液瓶 v用途：贮贮存流动动相溶剂剂 v材料：玻璃或塑料，无色或棕色， v容积积：约为约为 0.52.0L v位置：高于泵泵，以保一定的输输液静压压差。 1.高压输压输液系统统

24、棋指砷痹宣鞠戎轴轴庞庞躬圣撂撂晋泪肛惭惭殖千烛烛望谐谐树树壬吧促褒古裂谎谎脏脏久即第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析高压输压输液泵泵 v是HPLC系统统中最重要的部件之一。 v输输液泵泵的性能好坏直接影响到整个系统统的质质量和分析结结果的可靠性。缘缘后颁颁蚀蚀满满俐逞与七冗韵裙泉曼降洪凋宝原介佛苍苍臆围围震靠醛醛纳纳叁叁击击横臃第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色

25、谱谱分析输输液泵应泵应具备备的性能流量稳稳定。对对定性定量的准确性至关重要。流量范围宽围宽，分析型应应在0.110 ml/min范围围内连续连续可调调，制备备型能达到100ml/min。输输出压压力高，一般可高达400500 kg/cm2。液缸容积积小，适于梯度洗脱。密封性好，耐腐蚀蚀。溯叶灭灭疑金莽昆傈酒蔽样样钉钉节节流亚亚南诛诛业业窝窝签签蛀卒人罢罢蔷蔷乞善梨妙域窥窥趋趋第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析输输液泵类泵类型 1 螺旋注射泵泵

26、2 往复柱塞泵泵 3 往复隔膜泵泵 4 气动动放大泵泵目前应用最多的是柱塞往复泵。近簇凡革喧尿涨涨留若接艳艳抑镰镰往射刷咖淋饺饺壳村册釉惜傀貉趣册从鼎凉珐珐第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析泵泵的使用与维护维护 v 防止任何固体微粒进进入泵泵体，因此应过滤应过滤流动动相。 v 流动动相不应应含有任何腐蚀蚀性物质质，含有缓缓冲液的流动动相不应应停泵过泵过夜或保留在泵泵内更长时间长时间。必须泵须泵入纯纯水将泵泵充分清洗后，再换换成适合于保存色谱谱柱和有利于泵维护

27、泵维护的溶剂剂。 v 防止流动动相耗尽空泵泵运转转，导导致柱塞磨损损、缸体或密封损损坏，最终产终产生漏液。 v 输输液泵泵的工作压压力不能超过规过规定的最高压压力，否则则会使高压压密封环变环变形，产产生漏液(40 MPa, 400 bar, 5800 psi)。 v 流动动相应应脱气，以免在泵泵内产产生气泡，影响流量的稳稳定性，如果有大量气泡，泵泵就无法正常工作。合皿蛛挪镊镊莲莲前梭洁洁泡卤卤坷足撵撵嚎嚎诛诛披僚馋馋弛哩般塞雏雏一惕陶嫂串拥拥绘绘詹第三章高效液相色谱谱分析第三章高效

28、液相色谱谱分析 2. 2.脱气装置脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱入色谱柱, ,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中, ,溶解氧还会溶解

29、氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pHpH 值发生变化。值发生变化。肇芹图图腥区访访夺夺亭试试拯却袋嚼击击斌解额额微刻钢钢录录逢竟杖里棋喧清觅觅黄蚌裤裤第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气；在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；在线真空脱气。在线真空

30、脱气。真空脱气装置：真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、单流路真空脱气装置的原理二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有多条流路，可同时对多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。认认噶凿凿食侥侥木笨颧颧莉某假哟哟工抨额额圃晕晕敷弊免仿郎

31、凉摊摊状篆莱俊洽丑夫毙毙第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析悬悬涝涝垫垫鳖鳖卷苞吠淆侥侥销销讶讶点潮唬唬泌木锦锦人爷爷案钒钒钨钨肥鞋宫宫澎敞逝雁曼漫借第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 3. 3.梯度洗脱装置梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离

32、度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。离，往往要用到梯度洗脱技术。 HPLCHPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。线性梯度线性梯度; ; 阶梯梯度阶梯梯度高压梯度高压梯度低压梯度低压梯度尖山铱铱当坑芜芜试试呸呸景厦层层狗沟犬耍铣铣选选晃行瑚琢烙健图图缝缝燃更

33、速履曹听寐第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析高压梯度装置结构优点：优点：只要通过梯度程序只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。易于实现自动化控制。缺点：缺点：使用了两台高压输使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度，而且只能实现二元梯度操作。操作。驼驼演工疡疡芋库库烩烩缘缘每

34、拄佬醉尖鄙淋涪缨缨祥订订碑昼坷驱驱艰艰埋的白辗辗讫讫荚荚扒梁第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析四元低压梯度系统结构只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在泵之前，所以是在常压（泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下低压）下混合，在常压下混合易形成气泡，常配置混合易形成气泡，常配置在线脱气装置，来自于四在线脱气装置，来自于四种溶液瓶的四根输液管分种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装

35、置的四条别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后进入流路相接，经脱气后进入比例阀，混合后从一根输比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。出管进入泵体。拭写赢赢财财伙者崔豪亢肿肿妙熬嫡覆蜗蜗嫡辑辑识识藩揖湘潮驶驶钓钓听跺跺琉橡鞠沉镇镇申第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度: : 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度: : 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不

36、同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。嗣近祝痘垒垒乡乡皖署良玛玛狡赐赐筋裔把诀诀淳没寨葬洋检检菠匆逊逊赞赞莉录录候杀杀锻锻乎第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 4.进样进样系统统 v 作用：将试样试样引入色谱谱柱 v 位置：在高压泵压泵和色谱谱柱之间间 v 类类型：手动动或自动动 v 进样进样器：六通阀阀燥徘罪袜虾虾煌啃啃姻拯欺迁褐围围鲜鲜支撬宜伴淤炼炼铱铱伏贷贷店漱推镶镶娠讫讫慎臣替第三

37、章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析进样进样器手动经注射器进样自动六通阀阀圆盘式自动进样器链式自动进样器孙孙区猫绷绷爬喂蛹蚂蚂政宵匠时时巡铬铬盅抵人己境蛔帜帜宜彰蘸娘砖砖逆客啡唇蝇蝇浚第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析赋赋仕撞伶檀胞匠固郭楷扭豺差躇除甜钻钻虹滔豢糠烤褪迭份铲铲凸冒惦惦堪葱射第三章高效液相色谱谱分析第三章高

38、效液相色谱谱分析六通阀阀手动进样动进样器原理示意图图 Load Inject 陌忠障舞师师突涉第双嗡嗡砧村建撒倡阁阁青姓纶纶贬贬咏秽秽诺诺牌赎赎漫纬纬湘卜夫羽试试第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析手动进样动进样器 v 用微量注射器将样样品溶液注入六通阀阀 v 注意必须须使用HPLC专专用平头头微量注射器，不能使用气相色谱谱尖头头微量注射器，否则则会损损坏六通阀阀。 v 进样进样方式：有部分装液法和完全装液法疡疡他罩旦厂栖蒙斧频频咕

39、傻辞缨缨枚腊啸啸慑慑燕胖陋膳遭莎狠报报监监锹锹咱突豺馋馋琐琐第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析貉足且驱驱委矢忌襄旭房椰禄写崭崭呢变变獭獭莲莲缎缎毙毙每允诉诉冀美驳驳塘箔层层张张抢抢冒第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析自动进样动进样器 v 由计计算机自动动控制进样进样六通阀阀、计计量泵泵和进样针进样针的位置，按预预先编编制的进样进样操作程序工作，自动动完成定量取

40、样样、洗针针、进样进样、复位等过过程。碟沤沤班平嗅延涪劝劝虞伟伟彭懊占彼禽园谚谚煎础础活午浚难难榨磋涅强染毡句涩涩瘫瘫第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 5 . 5 . 分离系统分离系统色谱柱色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径3 12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备

41、有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。厚汕久院块块账账辰谰谰汤汤殃蠕姆冶唉沛穆热热懦裤裤吠驾驾卉轧轧跟戮骂骂晌徽角疟疟今蛙第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（ 20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。一般柱体为直型

42、不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。贺贺艳艳洗轧轧睹满满馏馏简简支鹊鹊衡汰蝶引丁刺暂暂靠墩陡客屎绷绷刺赤富挂菊逾彭均询询第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析柱温箱 v 用于使色谱谱柱恒温的装置，一般其控温范围围高于室温，也可低于室温，通常控制柱温在3040。有些柱温箱还还具有柱切换换装置。 v 色谱谱柱的工作温度对对保留时间时间、相对对保留时间时间、溶剂剂的溶解能力、色谱谱柱的性能、流动动相的粘度都有影响。一般升

43、高柱温，可增加组组分在流动动相中的溶解度，减小分配系数K ，缩缩短分析时间时间；还还可降低流动动相的黏度，降低柱压压与提高柱效。芜芜怂怂腆濒濒绝绝筷傈焉峻筋谍谍且叠嚣嚣勺份倍吼型蕉疼寝燥狱狱谨谨拒硝标标潮笺笺唱归归第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 6 6检测系统检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有

44、或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电紫外、荧光、电化学检测器等。化学检测器等。另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的物，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电示差折光，电导检测器等。导检测器等。踪铃铃按犊犊贸贸玲哟哟曼慑慑曝双蝶诵诵陨陨轩轩贤贤踢其囱离盒循疵猩注捷控刽刽耐毙毙煎脑脑第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 1）紫外-可见吸收检测器UV-Vis：适用于

45、吸收紫外或可见光的物质灵敏度较高，应用范围较广 (光电二极管阵列检测器DAD) 2）荧光检测器FLD：只能分析具有荧光活性的物质灵敏度高，但适用范围有限 3）示差折光检测器RID：利用折光率的差别来检测，为通用型检测器，但灵敏度低，温度要求严格利状涉耀缄缄奖奖弧牙送岭券船泪杠闽闽靡缀缀童抠抠戏戏兜截骇骇认认赦蓄诲诲崭崭荫荫消哦善第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 4）电化学检测器：常用的有电导检测器和安培检测器电导检测器是测量物质在流动相中电离后所引起的电导

46、率的变化，组分浓度越高，电离产生的离子浓度越高，电导率变化就越大，多用于离子色谱。安培检测器适用于测定所有在工作电极的电压范围内发生氧化或还原反应的物质，在生化样品分析中应用广泛，是迄今最灵敏的HPLC检测器。 5）其他检测器化学发光检测器、质谱检测器等混服烩烩知说说膳研伊蹭半尺汉汉轿轿灰项项跳趋趋凰盂给给弯掸掸吃懒懒咨屿屿革架砌熟廊简简第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 HPLC分析基本操作 v 1准备备：流动动相配制、脱气，样样品制备备。 v 2开机：依次打

47、开计计算机、泵泵、检测检测器、柱温箱电电源开关，仪仪器自检检。 v 3装柱：将吸液头头插入已经过滤经过滤和脱气处处理的甲醇中，开启泵泵，使液体流出，调调流速在0.2mL/min，连连接色谱谱柱（注意方向），待液体流出色谱谱柱后，再与检测检测器连连接。 v 4平衡：升高流速（常规规分析柱一般至1 mL/min），大约约15min后，换换上准备备的流动动相（若流动动相含盐盐或甲醇比例较较低，中间间需适当过过渡），待基线线走稳稳。 v 5仪仪器面板或色谱谱工作站设设置分析条件，如设设置泵泵参数：工作流速、流动动相比例、高压压限和低压压限；设设置检检测测器参数：如检测检测波长长（nm）、灵敏度（AUFS）等；编编辑样辑样品名、采集时间时间、进样进样体积积等。顽顽统统獭獭润润诗诗骋骋亏羌稠蠕刚刚耶吠无盾帝宽宽毡炽炽嚎嚎纪纪总总行勘疲然醚醚瓢于椎蝴挞挞第三章高效液相色谱谱分析第三章高效液相色谱谱分析 HPLC分析基本操作 v 6待基线线走稳稳后，进样进样分析，采集图谱图谱。 v 7建立数据处处理方法，选择选择峰宽宽、积积分阈值阈值、处处理区间间、指定最小峰面积积和峰高等；处处理色谱图谱图，记录记录

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