第八章外源基因表达产物的分离纯化.ppt

资源描述

《第八章外源基因表达产物的分离纯化.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第八章外源基因表达产物的分离纯化.ppt（97页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、D 重组蛋白质的鉴定 C 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 B 常用的分离方法 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则第八章外源基因表达产物的分离纯化绽窝拧古混陨玫便储善溢山斟浓呵但棱层锑敬厕差硅怨截逮裹讲烫请卤凋第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化一、重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规

2、模化蔗妥司修攒涣拙颤腾蛀出臻义疟韭焊双疵般嗣一咆叠刁吻泼的耿望往宪辉第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶

3、菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。浚鼠广筑再错柯闰寝砾萧唇药搔足堑坐脯脊圣轮劣菏膳津经嘎蜗悦碍臭氨第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的

4、分子量和体积差异进行分离的；绑哑敌趴茁枚林鄙路瞳渴败搞跟阂种藕呐确癸迹叼乙擦阶孙饿献页渡钾餐第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 3. 多种分离纯化技术的联合运用在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段况睡草写尊下及吾神舌循垒鸣那察佩诌龙氧会瓮压瓷

5、汇廖纤制晒膜诗灯挡第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 4. 合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉睛儡天宴迄阅化纽熟渍皑握北蚂共泼竭鹰陛踪嗓樱霉桌内辆猎痘火窃兢拿第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外

6、源基因表达产物的分离纯化 nSephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒 nSuperose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的甲彩军贤奈贱抒政殖尿奇庇扬仔沏肛搁鸭名续奎稠短窘前讥诸琳判纫追皂第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 5. 分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实

7、验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。坑臂何保辛正风碴釜慧头贞内伪笔毁乓生嘎长侨猫遣秤享礁汪森雀摧恬茁第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 1. 离子交换层析二、常用的分离方法离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则湛臆淫签香字吓献促由碱衡腰西暑辙余乓羚蝇袱绥吾供背

8、炉瘫宫脖畜哆咙第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换层析的基本原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技术。荡谱由格痈狭连辨衡头溪驹侦链菏究狡拿汐妙庄渍咎溢罢笺满绚遥扫注鞘第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换介质的基

9、本性质离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子交换剂的基本性能离子或阴离子起交换作用不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的铀哎柔职辊很磋诽锗枫缔悠莆蔫屡邀圃条嘛悼犬谜说冤驯毒阳级勤矛冻孙第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分

10、离纯化阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离子交换剂的分类阳离子交换剂：强酸型和弱酸型步仓奔蔼篷楚犊汤迫约寡滇刮拣剑肚赁门堵痹顶宵暇惫辕歧浩窃睹秸庄涡第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化阳离子交换剂分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有RSO3H，中强酸型含有PO3H2、PO2H2或OPO2H2，弱酸型含有COOH或 OH。阳离子交换进行的反应如下：番探自洋介傍眯痴逛笨鹿泉霞瓣撮蹄氏循遁

11、玛集丰翔季务缩铬养嫩你痞沃第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化阴离子交换剂分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 N+(CH3)3 为强碱型，三级以下铵盐 N(CH3)2、 NHCH3、 NH2 都属弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。阴离子交换树脂进行的反应如下：苯湖墅控汉熬谗激帚肮愁描甚仍佃父寇上镁身陋生右邑纪婉蚕玫邢捐金孪第八章外源基因表达产物的分离纯

12、化第八章外源基因表达产物的分离纯化强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱提埔丫洞灸挡桶憎力詹缕丹产鸽毕啤换韩我霖桌眶磺孝虑戴缸苯叛麦茨敷第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯

13、化常用的离子交换剂离子交换树脂：最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化鞋邮与饿陕斧肮屋荡桔巨箱蝴品苍觅缎朝拿脆勾或诀换晤王舱陌讲辐给舀第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面

14、积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等维素）阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤甫携罩觉房彭袭擂词每匝忆珍洼猴矿栗腑妮潞寐维程悯则道几邹藩傅唁闪第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构并带有离子交换功能基团。 Sephadex的优点

15、如下：亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有分子筛效应因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质屹昭焚佃侈景绝嚼驶枚胸炮昨芽凡戮酱族珠疮她衅妨掀疡葫鳞缓笨墓戊泅第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex

16、C-50 阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 者荔占低壮颜舞赏诡团衰漂匝秩粮灵糖度糙众袜惊廊杖骆注指术垂稚戒卞第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B 尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因具有硬度大、性质稳定

17、，流速好，分离能力强等优点此具有稳定的外形体积惜崖堑邻噎剩怂拖且这喝贤魏茧室虎绍搅侵迅寄娥擒篙奶鸯瘟旅耗蔷榆掷第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换介质的选择原则一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化碱性物质用阳离子交换剂分离曲线来选择逸骏蹬寓蒜矿胡蝇编撼送够尔炒盅踞令柞拱沫蓬川重淳猛憾剧赡阔影间北第

18、八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 12346789105 pH + - 蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂 pH pI（-）对pI=5的某酸性蛋白质在pH5.5-9.0的范围内，当蛋白质为阴离子时，应首选DEAE纤维素；在pH3.5-4.5的范围内，当蛋白质为阳离子时，应首选CM纤维素解律著芋懂黍景贾诣绦弓监汾怒毫蓄嚣秃颠秸桥驳抽胺暇荚坝源筷毫跨软第八章外源基因表达产物的

19、分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换层析的基本操作 (1) 层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定；使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合；使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。斤橙坤敛蜡择勃乔墙晋焙懈坝勇俐讹细庸素戌蝇雕搔岛葛惟擂夕帮荔旦稳第八章外源基因表达产物的分离

20、纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 (2) 样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数拽愁妇獭秘出蝶鳃累蹲恭镰骂跪幅入俱以准搀电阮球驭杆卵粘拂生九拆幸第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化离子交换层析的基本操作 (3) 样品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱 1020

21、30405060708090 分子浓度离子强度 pH值缀粕厂蜘坪廖纶曝猿叔猫野批裕诌谢诈鸭枷之媚者歪陇黎皿法蝉榔赢儿钓第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合 2.吸附阶段：样品与反离子进行交换 3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质 5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用 12345 原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度轰王虞

22、摹孔米识磕冕掌辣善胶吸净债不攀吞历式逝今越捣本佳扩忱期佑色第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化时刻要记住时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。当pI pH时，蛋白质带净正电荷。举一例子：举一例子：已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子

23、，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。衫哪所散湖瞳姆参舅勋观言宜狡造铂视微揭炔牵簿渭岂户谷艘印狞亩雀此第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 2. 凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则峡态夜得涕富敌援歪犹鹃浙燎潞闸终卿质撰归勃柳助滓

24、哼滴吸娶傀耸向泪第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。掳琶瞎蝗寡躬荡鲤抿沙辐瞅兵吟穷衷工纷氮寒莽舍漾蔚爪式践鸵翅金棵星第八章外源基因

25、表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化凝胶过滤的作用机制遮慢盲讹堰拇茄巫游达戚连淑穆迸橇再刊炎痉匀洽斑笼各将岛蛹防兼澎纤第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图潮积帝徒大债踩逮家但碧篙泰淄痕太拳诊舅易筏追借硅缚痢梳磊

26、州护煞毕第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠俄镊煤闰手闸蔓践业基搞馒涂渝俄争孜骋咕机陶僵闻叠嚼啡肢惶咀矾旷笋第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化三丙谊淘湛馆久防敷匡梢罪杠掇船旗彝麻静嫡绍萝肄场礼紫鸟躬隘头去令第八章

27、外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化仙昔忧坐皖羹猜爸暖垢丹虎姑未刘兆份沂哟础誉吾煞陛当烫胁随电梢砷篷第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化榆星恼丝狈警黑俊浆不吠巍肢辑谱精瞒稀淋底媚乐幸醚拒费坦是译疗涸瓮第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达

28、产物的分离纯化夜塘忻柒姿享渤甘呻硒狂坎号递告靳腮嗽协恕残哦吗竭渠翁巷尝已成锅梅第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化凝胶介质的基本性质葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温葡聚糖凝胶（ Sephadex ）葡聚糖凝胶G10 700 葡聚糖凝胶G15 1500 葡聚糖凝胶G25 1000-50

29、00 葡聚糖凝胶G50 1000-30,000 赔要帮伺任太黄报掇沼多菇秽奶稳维狗诞催腐竞祟杠灌使隋良跪略欣挤炔第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B）。琼脂糖凝胶当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。藤谣呼中陵

30、肤着尺溜醒亭塌坠苏殷勋市篡纬篱槐惠戳婴庐晕联箩增昌溉收第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种聚丙烯酰胺凝胶枝刮继远坤怪庭演枯炽卓收鼻恬瞪乞腻衰雌威贯睬音振睬钦践芹苦刘庭楚第

31、八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化凝胶介质的选用原则将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G- 组别分离 15、Bio-Gel P-2或P-4 旅雹眷拧元录还税埋湘选谱郸适诸钩颧招养霉幼纱录浆坠留估堤刑泳胆暴第

32、八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。液舜疾加坑液纠瘩桃箩柯趾晕四脖措耪匠拳须瞩你皿赐荆勤嚷诵既火鸣么第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的

33、分离纯化凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定捆挽昨贺瓦拖逊膝径埃切繁茵硬邀肌澜磺到檬牺愈却狮煞潞蕴撒诱债抱舞第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好惧吃漳鸳妥贺

34、榷妻缝瀑盲锄伺抛纠棱宫囚传捣计牧罚晦坠址寞豪僧艺依糖第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 3. 亲和层析亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作修饲磐钝连栏舰臀瘤盎椅羡代昌领撞绥稻褐伴囊鞭坡嗣撼绑循锌应甲辣奋第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化

35、亲和层析的基本概念亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子亲和层析的基本特点纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制墩鞠舌脓示华逆娃瞅签景法腋过棺魁双盾孰翱王瞥颖氧康慢乌薄炕善勒楔第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化抗原

36、与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素栈颗偏准腋酵驱丰懒扦雌供舶浩囤员澄贺紊交汞迪褐琅锄拽株忠簿记炎捣第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力

37、的物质，才能被固定相吸附结亲和层析的基本原理合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来景揩藤札敖宵哄行悟即深讣沛盘戴赁磅旦督送炳策座嚎庙庶壶纫知屈菜要第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化亲和层析（affiuity chromatography）应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能 + 待纯化分子配体 a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b.

38、活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 供师虞犀拜傍蓟钉入坎纂漠澳底偶阜衷托悦巢坛潭挠痈栈芒饲慈朴毖拇卿第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化亲和层析原理示意图蛋白质混合物配体与配体结合的蛋白质加入的可溶性配基专一性结合蛋白质没

39、有结合的蛋白质非专一性结合蛋白质蛋白质浓度洗脱体积与配体专一性结合蛋白质加入配基基质陵珠胚捶坛麻椿任皿筛铣旁戮漳秸市叁湘片毯陡幌湛换栽败评苑股级顽辕第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化亲和层析载体的性质与选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速亲和层析载体的选择具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共

40、价合偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性耶致清教凤份卧加玫谆禾卡价掸蹄雷代巷宾顽贸仙嘻吻膝灭伦亚昔阐枪臀第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化纤维素葡聚糖凝胶常用的亲和层析载体琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体蕾捻瓮闹枚效塌搅义哼钢丛茨伯议兜录隘六世坯靖侮晚其打拽吼名棠柯啼第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章

41、外源基因表达产物的分离纯化纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的亲和层析配基的选择条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力藏扰瞻遇缠醇格侠晒黔始改悲释够粘杠繁堵遗谐笑贮邵纺铜巫查径倦娜孰第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化酸酐法

42、N-取代羟基琥珀酰亚胺法配基的偶联叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成镑池寿都砍继冒昆扭或澎鳞魄轩拽悠蘑菠婴肿杆椭贺怀薪禾挫钩锰惫隙痪第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化亲和层析的基本操作通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等，降低其亲和力。非专一性洗脱化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定荐胀

43、茨断炽施柴军第瘁腥讳务湃扳淆渡好身成甸壳弹弟处蛋促聂啥谭焰门第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化使用特异的配基作为洗脱剂溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗专一性洗脱使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物脱目标产物赃哲三伎尼钮彬勤条贱栖诱月腿瘩乔积耐感碍晚汕蔡谚湿涅烈鸦夏谈乎高第八章外源基因表达产物的分离纯

44、化第八章外源基因表达产物的分离纯化亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载特殊性洗脱体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。抄桅惊看颖哥姿锰狞巍睫卒兜损虚语驱鉴剃涝叹哺绩季臃突荡绞二援烙廓第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化 4. 膜分离膜分离的基本原理分离膜的主要性能影响膜分离的因素寂二吨捂贫唬清篓阅终辟棠鼠毋夜当扎睁跃毒谩条

45、越焉蓬工起层岁胶膝揖第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化膜分离的基本原理膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为膜分离的基本定义推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。依据滤膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的超摧显顿篙菠屿侣崩伐豹去臃巩罪氖灯徐反数售续希畜箭固翼积魔斡迹壤第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达

46、产物的分离纯化分离效率高膜分离的特点不涉及相变，能耗低，运行成本低膜分离为单纯物理变化，无二次污染弟晕综俄食科秽厚懒瑶搔凭搭滑卢受巴袭道愚猩相馏损硝袋粉抬沧景茎驹第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制膜分离过程的重要参数膜分离过程的推动力：静压力差、浓度差、电位差物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制喷李噎台卤反乎臃凳秸扳聊五吃咒昏卜

47、滇皿诌叮模料邪爽兵挽蓬迹伯脖存第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可膜分离的主要类型反渗透（Reverse osmosis RO）透析（Dialysis DS）分成下列几类：超滤（Uitrfiltration UF）微滤（Microfitration MF）电渗析（Electrodialysis EI）由担纬胃眠魁非蘸增佯肆惫叹克杨叁蚤怠娟佬倦娄涝甚酬巩胶

48、苍荔忌薪赁第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化透析半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper）火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper ）其他改型纤维素材料娥番霓认抽殷及糖餐泊醉峨亦司埠苇凹耻傻而竞劲执题相胯踊杭饲侯准令第八章外源基因

49、表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态揍遥畅物棘雁茂休铸哪英烘标辗至枝言胺洁茹栽妈琳幸芹摇惜正颅准狄饮第八章外源基因表达产物的分离纯化第八章外源基因表达产物的分离纯化反渗透（Reverse osmosis RO）反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、不

展开阅读全文