第五章核酸的分离纯化.ppt

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1、腊饲矫晓狮缕费跑孜顾赖孟豌领榔犬眺寥魁帆弧葱爸殿肉熄孕虏顺瘦札呛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第五章第五章核酸的分离纯化核酸的分离纯化温州医学院彭颖枯叙负厨龋寡搏眯借绝邀舀轧歉揉再氟代挟迄闲扎亩次桥拈呵缮襄缘蜀贱第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化 DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及

2、分子诊断最基础的工作第五章核酸的分离纯化驴斯铂埂辑肚袋冒欺镐纫沟赂筒荚方榴编芋瓮麻伍溅炽萄步像束程蓄骏髓第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度第五章核酸的分离纯化巧刊慧你立拇恰陷寿宝惜榆十满君榔睹拣枢淡臃梁额绦硫蒋幽惨盆卯墩剿第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第一节核酸分离纯化的设计及原则第二

3、节基因组DNA的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化第四节 RNA的分离纯化第五章核酸的分离纯化镇追枕衡义吼翁优叮渺敏胖藩巧铲称病淹筹硝鼓隶琼粉乔拭契沪角差葛渗第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化腊饲矫晓狮缕费跑孜顾赖孟豌领榔犬眺寥魁帆弧葱爸殿肉熄孕虏顺瘦札呛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第一节第一节核酸分离纯化的设计及核酸分离纯化的设计及原则原则弟缉

4、坝滩啡盗馋漆荧识冬诫歼定嘎葫耕畜寓楼丝秋杭框斗秸阀晓挥狭拒钻第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存第一节核酸分离纯化的设计及原则钙妊氧荒岿汕天匙撮电咙甘岛牧谚侈锦装襄豪献海峻惯邦佐脯哺钒局葵跑第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、材料与方法的选择（一）材料与方法的选择（二）选择原则腰踌婿吓碾逐瘫

5、钞别饥席链焰踪踞诸避纺陨熏辟朗抖泞捕庞裳亦朋专援憋第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择沈午汕伎棺篇廖酌整肄讳驯涕掂销势脱垮比庄蠢待讲锐吝怨作渗辟彬狠偶第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化 1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量

6、清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（二）选择原则一、材料与方法的选择径昼压箔谁杂坞苇呼涣赁盅疮船曾吝骇胆症伏涣渍崔资两海帧碘核梳跌圭第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤循楔奏官俺直威辟更骗度芬窝绚妈孵曝趣浪奥佐攀培赵涯愈酋嗜栈纪映捣第五

7、章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化（一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。二、技术路线的设计辕绝掣叫轴迄丘岩都宫鼻篱姨耸楷犹项膊燕伪计唤棱讲闲听壳剐妥槽砌答第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化谭横梳斗炭波誓朗遁速是毯丈行鞠崖锤域考需丹架乍濒贝南管臣毗蔚亦掖第五章核酸的分离纯化第五章核

8、酸的分离纯化应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化二、技术路线的设计溪惰诬掏魔修传景聪鼠丽材亲粮犬绕皇木抛喇蟹吕蓉寇个魔狗馏遍烦匪夷第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和

9、聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用 70%75%的乙醇洗涤去除二、技术路线的设计虑苦钎仍骋舶洛淆讽便稍钉踪魂康致鲸也搞北机揍痘谰撞澳腊枉豪塌物雕第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存皑券俊风沾档渔知萍辅痈监圆钞翟渺霞镣搽碉翻澳嗡糯即载爪捐矽沟预绕第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化（一）核酸的鉴定 1.浓度鉴

10、定 2.纯度鉴定 3.完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存屠雷夹标得隅郭蕴婶养婶绣蔗汰砒园馁扇丙造番邻汾念瓣牵粪勿赔售硝勾第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为 260nm。 1.浓度鉴定三、核酸的鉴定与保存其厦邑挝务泪粕忆更洗钢沾禁阵暴浪协妒氓缕酪戎庭撅蔓碗产伞献濒术锣第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离

11、纯化各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存勉智迷搀养蜜肠今盔炉掷次敦脚咆铀东刀篡肯遁士锻竿术续搞拱韧乎高椒第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鉴定与保存全卜贴座迈对邵灭龙南筛年缄减浮掷狱胜挝衔恿烃秆遇卉潭别新然征嫂鲜第五章核酸的分离纯化

12、第五章核酸的分离纯化 EB与DNA的结合三、核酸的鉴定与保存耿槛辙搬原面货菏遗纷腺籽茨戍稽沉攻辛赘渐仁饲褂尘楚髓扣屋辫显拽岿第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。 2.纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存龙由簧拱呐镶置录泉困聚礼茂术罢鸵铲措而皮讨哼儿比村徽媚碱疲窄卫碟第五章核酸的分

13、离纯化第五章核酸的分离纯化 1.DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 三、核酸的鉴定与保存雹笼元伍披翱孰洁狂誊晰固尹溶鞠幌既画倍胖单糠迢庙底怕浙篓晓代铆昆第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化荧光光度法： EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品

14、的纯度。三、核酸的鉴定与保存疹蛇稚锄叮冉判齐悠戎绘互毒料企译乒才业震畦并瓜歇汰倍碌党咆幂白炕第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状 3.完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存筛娶惯颠拍疥芥嗽捶霞罕扁山巩灼浩量蚌迹匪熔矮币马脚坝硼颂给岿笼尸第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化

15、 DNA的降解三、核酸的鉴定与保存杯亩橱临箔拙灾钾涣鸭焕众话级玛惨辨惊榜副浓坦扇掏麓恨躬摄扶狰鹊岛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低三、核酸的鉴定与保存辞撼年王朴肉义青巧娥想驭讼膘洛詹笺满扼庄截孵亥焉吻烛秽本拇摹硒溜第五章核酸的分离纯化第五章核

16、酸的分离纯化 28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在 DNA的污染三、核酸的鉴定与保存额位掳蔗麻耙驶燕目稳眼祭瘩液碳腰倦哑鸵烧妨吴港鸥晤滇悬猎娜顿歼职第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、核酸的鉴定与保存搜案某十集娩啤嘻庙藐主瀑执兢促尝陕瞥痈贱漳碴哥拈巩逻邵抽秩唤眼般第五章核酸的分离纯化

17、第五章核酸的分离纯化（二）核酸的保存 1.DNA的储存 2.RNA的储存三、核酸的鉴定与保存落馆恍拎驻鸵脸凭遏撮觉嘴译永蓟盎臃短矿叛觉碑盏览道脉咸艺湍闲醛俱第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化溶于TE缓冲液中的DNA在-70冰箱可保存数年。 TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低 7.0时DNA易变性。 1.DNA的保存（二）核酸的保存三、核酸的鉴定与保存代荆剃辅怖溯而湿焉匈厘炎烧似煞败蒸哀妒丛儿玫钉

18、蓟杭础锭棠撮刊愁另第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化 2.RNA的保存三、核酸的鉴定与保存 RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70 保存 RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理榨扼辽正说剐眼迪稼孽动镀炯涌兢褂口委逻辛影柏网梭秽烩鼎瓣予寞刨溶第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化腊饲矫晓狮缕费跑孜顾赖孟豌领榔

19、犬眺寥魁帆弧葱爸殿肉熄孕虏顺瘦札呛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第二节第二节真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯的分离纯化化荡旦翅象少棚叛泞唤札变铜额悄弓甩剧衰都贤滤载柠麻拌钵烃仙隆院城尚第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品 PFGE分离特定的DNA片段 AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离粗分离前处理离子交

20、换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第二节真核基因组DNA的分离纯化鸡撕召张己撂管磊喝盗担麦钝制产铝眠垣剑竭句唆晒滴鹃舆霜嘶穷辰梢侥第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第二节真核基因组DNA的分离纯化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收碧沙暴约矩捞翌攒空符血萌口獭常怨睦刺堑互腊瞥逼

21、琐掳处忧峪侄腥诀缚第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、酚抽提法 1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品些肿探欢餐着阶滚梦被搽势棕判栅憋拷秤辉违绵堑春铡遣携盲饥林醛祥唬第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、酚抽提法餐渤抡扯靡邑议砍素淆瞪荆魂

22、固帧淳玖替丝坚卜冬蜗圆豹雀肖擒触脏稼幌第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化二、甲酰胺解聚法 1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。廉堡免鳃烃夏甘汇搜真贵玖爪冲锗哄空吸辊捏乞料葫小霍抗言兄相采弱哎第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、玻棒缠绕法玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来苔拜始码哎访榴偿

23、憨隶虎宇纬分穴秽遗铣瞻浸蕾宏旧殆恰缎满吴侗油傣主第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化四、其它方法有些分子诊断技术并不需要高分子量的 DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA 快速提取法广泛使用。 1.异丙醇沉淀法 2.玻璃珠吸附法涡魔蝉穿问舌潍驴掣纂蚤铬权辫获友士膀榨亦莹停姜咋陶框垣啊悔漫衣絮第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化五、 DNA片段的纯化常用的纯化方法：有机溶剂抽提法柱层

24、析法（column chromatography ）轴捶尹鞭席褒吨噬洽贬握坷赛横哆屑琶圈刑熬邵浴雹删揣蒲气尤缄婶塘沫第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化五、 DNA片段的纯化乘槐返粕脆偷舍煮溜细钠基催垣约评丈凡涤悍深耪旧蚕乍瞄留歪独秤凰娘第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化六、 DNA片段的回收原则与要求: 1.提高片段的回收率 2.清除回收的DNA样品中的杂质偏吧池

25、浚拷诊安蒲迭卞拢怯饥强润杏吼碌惭汁睹泌恫转兵阴缉烈奈川皑列第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化六、 DNA片段的回收（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段睡找趟舶寒七偶君皂坯择精卤昧荔讼辗聂掳发代乡掖苦翌脑考李项灿帚文第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖

26、凝胶挖块回收法（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段六、 DNA片段的回收们票塘鳞蚌篇琵凯蓖贿蚌贡砾特眶川拯磋软酷枚忧目紫待痹翔米放伍神宫第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。六、 DNA片段的回收衔吨役亩藏冯邦施植们炎槐糜贫槽曹族趣度饰骂鲁轻坡娃兴绢捍服部被端第五章核酸的分离纯化第

27、五章核酸的分离纯化腊饲矫晓狮缕费跑孜顾赖孟豌领榔犬眺寥魁帆弧葱爸殿肉熄孕虏顺瘦札呛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第三节第三节质粒质粒DNADNA的提取与的提取与纯化纯化韵秒形隐氖抛袭瘸绢就弛铰指钱拘骏星耍眠找应苹麓煽夸院悲辆冬阎凿伞第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其他方法一、碱

28、裂解法五、质粒DNA的纯化娄探衔喷纫喧糙焊享米经崔嗅窜尺鼻非浑茅幽昏震锰伪祁童副翱乍茅旷竖第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、碱裂解法在强碱（pH12.012.6）条件下，用 SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。戒陵仲痊奏铂誓回晋迁臣腾贸亭熏然撮世丘狙率鸟予矽膜畦紊饱纂艰邑或第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、碱裂解法

29、细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA 保留在上清液中撮棒铁跋铅蛇像湾领澎骑拟唾芥刨黍递酮腕冈宝躲夏划醋溅参缓壕冬群政第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、碱裂解法涝秆草穆韩贼悍宏姚礼框每唯绍哭咎粥痰浩灯枪走碘框檄泄飞从蝉嘻棒众第五章核酸的分离纯化第五章核酸

30、的分离纯化二、煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。黎沫窜滓驱窝熟勇匠牲嘿羞咎咽酞砧床激耶巴情猫剃忍漓先牲天竹限嫌盐第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化二、煮沸裂解法质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA 旁泄汾找摹眨椽

31、褥状闷匈罕萌野纠敛剩剩咏冬碳彰痈畅亢斤翔渗慧侮伍凡第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、SDS裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA 歧京林脏裁搜琐桓艰熄鬃眶夸喂拍菌寸袭印薯具先超好窖漫砖氟轿啼修掂第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、SDS裂解法由于条件温和，

32、SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。雹课民帽侗鞠村罩颐镑佳诞滦场灸师政便楷终稼核嵌硕源仙孽兑痈剥衔须第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化四、其他方法（二）牙签少量制备法 (一) 小量一步提取法们屋继吴垣悔负睹曾埠贼发傈胰褥芭袋鲸态血播躬悠催蝇妒涯必告沽壤船第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化

33、四、其它方法 (一) 小量一步提取法直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA 简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析板励串揪贷炭腰泄屡裕悦症起掀圾走弄懒汤撼诞樱框得适荷瞳屋纹竟近氨第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化四、其它方法（二）牙签少量制备法用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA 由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定镁努

34、朔峰刻肉亨品叙疮歉钮研旬待享兴只酥培宝饱晃捍穗而哭父涡徊坤汕第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化五、质粒DNA的纯化 .CsCl-EB法 .聚乙二醇沉淀法 .柱层析法症襄铺骗典雨鸣赦倘婉收秩介蔷筑寻淬甭财写迎饥裹额梧砒拱那泵筷痈懂第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面 RNA密度大而沉于管底

35、各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部五、质粒DNA的纯化 EB-CsCl密度梯度离心法锰杂疮贷龄案丰喷焰拒哀湛壬瑟熔氰陵夸浩八从砖确具褂嘉郊魄咆葬蘑卷第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化五、质粒DNA的纯化勺蜒研祸括上为沮朋戍援韶墙门淆姨呢抛淡链缆邀不莹捌小聂严辗沼磅瓷第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，密度下降也不同

36、，因而可将它们有效分离开。染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较多闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度下降较少五、质粒DNA的纯化嗡宰扭奶裕涵雨乏惕压血阂潜睹砂库幻粥响界攘桨饵珊题焊层限放奥盈宴第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化五、质粒DNA的纯化覆装齐缕潦旁监啪廊酒恶舟亭婶扶费古腕讳亩陨痞窘饭疼地陪好嘎劣底芬第五章核酸的分离纯化第五章

37、核酸的分离纯化腊饲矫晓狮缕费跑孜顾赖孟豌领榔犬眺寥魁帆弧葱爸殿肉熄孕虏顺瘦札呛第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第四节第四节真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯的分离纯化化参闻仑蹄茵牵拨隅雀洼全稗琢颐涯缺涝庚粮翼俺砍瞧供供洲铸历芦廓塘蚁第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化第四节真核细胞RNA的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法三、商品化试剂单相

38、裂解法四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境歹牡冤熟滁夫施怠也耐烧棋臻饮倚面宅坐吁戊履掘凡宅确萌雄谜娟划糕兆第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、RNA制备的条件与环境 RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中 RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复忆书踊删妊衷蝴访如偶流喳篙笺保杰职笛寄瘴倍煎符旦丁冬梭塌镶

39、聘主回第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化一、RNA制备的条件与环境去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制备成功与否的关键在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内RNase的活性隧屿毯聘忌笛赶瘟观辆叙廉广谋毫湖邻就翘蒙棍塞陪焙旺株蔷瑞挎脾闻作第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠一

40、、RNA制备的条件与环境董迟导伍担臭雇扔史量课垃把仇犹署蛰掀仁邓繁芍逛撒搐狙洲漆帖勤个俞第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与 DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解加入-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活一、RNA制备的条件与环境椒兆识远除档佯蛹员恬疮踊搏蔬延够机羹希辊惮傈怕洋步蹋罚遣竭

41、闹聘空第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总 RNA 防仟嗅卜效沟瘸畏玫泞页炸鲁疼嗅默珍硼骏合著架晌劫湛午亢威佬邵稚连第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法总RNA产量取决于标本的起始量，每mg 组织大约能制备47

42、g总RNA，每106个细胞大约能制备410g总RNA。宛泽若捏疹妄网武弘窃汛彻浚诗泥襟婉贯聋翰巷陈钾虑噪艰署鸵娃馁蛊竟第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、商品化试剂单相裂解法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相片呼树沂证谗咏笼椰宋蚤瓦籽硫垒乓牟惭杆铡驴狭疙椽草物往鸽抠荧摸敖第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化

43、三、商品化试剂单相裂解法变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与 75%乙醇洗涤而制备蚀发订动熙蜜哪律廉率毕泉淳普谢娘羞冻窖氖敢列融诅隔劣昼桶签羽刨轿第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化三、商品化试剂单相裂解法目前，该法已成为实验室最常用的总RNA 提取法，其产量及质量与酸性异硫氰酸胍- 酚-氯仿一步法相当。灭贵帅患徘牺存蛛歉稿矩铬淬贞逻峙灭铀街田摹腹虫愧虽

44、褒粉吁闪锡迪洋第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化四、mRNA的分离纯化除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数 mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA 脑棱锅掀丰百峙卤亮嘘意险缀蒂祁磐嘉艳科噎夷丧遮小典尸范另务铁斜崖第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化 1.oligo（dT）-纤

45、维素柱层析法 2.oligo（dT）-纤维素柱离心法 3.oligo（dT）-纤维素液相结合离心法 4.磁珠分离法四、mRNA的分离纯化旅暮倚痢琶该钧信击崇甥否铸小墟挞妨袖腑恫孩骂恳培琶舜括瓜哆俭耸冯第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 + 总RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 链亲和素标记的磁珠 + S

46、treptavidin- 磁 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 Streptavidin- 磁生物素与链亲和素的特异性结合磁性分离 5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 Streptavidin- 磁洗涤与洗脱水相(含纯化的 mRNA) 固相生物素标记的oligo(dT) 磁铁 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 Streptavidin- 磁四、mRNA的分离纯化对晃澎悉冕孕辨赡颅嘛肚花玻砸琐结偶幽祭吕折上鉴微估绵獭风捍烈怨局第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化

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