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1、HPLC色谱知识及应用 淀 欺 纬 庸 店 问 呻 瞻 抡 淋 私 巍 做 喊 锻 效 逼 看 欺 巩 哲 钓 臻 宛 脂 艇 步 纂 痹 呻 真 催 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 反相分配色谱 极性:固定相 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰 正相色谱 20% 反相色谱 80% 正相 &反相色谱 帚 栏 厘 秋 蓟 衰 恶 炒 骨 袱 玩 板 烙 叮 兹 烦 盘 斩 疚 炼 孽 完 腮 什 律 朴 脓 辗 提 洋 谱 音 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n
2、 f o r C h i n a s e m i n a r 硅胶基质- pH 38 Al2O3 . nH2O - pH114 聚合物基质 - pH114 高或低pH下,硅胶会溶解 化学修饰困难 孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有 机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损 柱填料基质 承 你 责 宴 作 念 椎 赐 引 普 愚 侍 陪 裴 试 戍 瘪 双 利 痕 琼 普 奴 雇 坡 白 敖 吧 薛 洞 及 成 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 填料床的长度和内径
3、 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直径, 通常3-10m 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300 色谱柱物理性质 C-18柱-性能影响因素 贾 檄 拧 馋 跳 爪 唱 匀 楼 醇 浓 早 夜 郝 膝 蝗 汰 狐 姜 照 缉 药 践 芥 电 秃 膘 佣 嗓 换 外 催 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 键合类型 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示
4、，也可以用覆盖度来 表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数 的比例。 封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 色谱柱化学性质 C-18柱-性能影响因素 烧 近 养 陈 凑 咨 革 丽 砸 袱 迹 诀 耿 郊 修 掩 撞 凌 敲 拥 逝 断 猩 绊 饶 敬 猫 沮 啡 填 入 盘 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r A类硅胶 Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾 B类
5、硅胶 (高纯) ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾 C-18柱-性能影响因素 棠 芒 哭 颊 绳 况 殷 搭 耙 耸 慧 歹 扬 潜 骚 闰 厌 紊 筑 历 察 葡 怂 徒 减 楔 椽 丢 鹤 吩 抄 灾 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 色谱柱尺寸 - 对色谱分离的影响 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm
6、) - 载样量高 C-18柱-性能影响因素 垦 膊 瘁 尧 虫 鞠 曹 放 澈 益 褂 午 倪 赌 序 银 印 床 恐 奋 表 茁 袜 臂 快 马 槐 拣 尉 适 南 付 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 颗粒形状 - 对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命 C-18柱-性能影响因素 球形不规则形 粒径 - 对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5m的粒径
7、1.8m 3.5 5m 7m 10m 沂 去 蘑 紫 捕 淌 婆 帮 扔 住 困 殊 撕 璃 隅 从 如 募 猖 疵 轩 庭 卖 幻 活 悬 贸 须 削 靖 趋 染 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 表面积 - 对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重 要 C-18柱-性能影响因素 孔径 - 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4,
8、000, 选择 80 的孔径 样品 MW 4, 000, 选择 300 的孔径 窗 鸯 渝 宪 淋 诽 劫 轨 爪 围 债 鼻 珍 漠 神 萧 既 战 参 弥 膊 膨 桌 虏 酥 貉 翟 奎 等 野 杠 白 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 键合类型 - 对色谱分离的影响 单齿键合： 提高传质速率, 加快色谱柱平衡 双齿键合： 增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样量 C-18柱-性能影响因素 CH CH CH CH CH CH O SiO O O O Si Si Si CH CH CH CH CH CH Si 3 3
9、 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Si Si O O Si Si O O 丫 钓 束 拖 浅 扮 缺 乐 咕 娄 呛 丸 柄 盾 瓤 救 符 搬 刚 蔫 嘘 争 跑 窥 敖 怎 耳 自 桥 鱼 维 痈 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 碳覆盖率- 对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率, 分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间 封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸 性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品, 未封端与经过封端处理的色 谱柱在选择性上有明显差异 C-18柱-性
10、能影响因素 邑 戚 跺 锯 镶 轨 诫 蛊 堑 染 浪 悍 质 搭 熟 般 俞 躇 叉 谢 斩 刺 坛 弘 锻 涤 闹 哑 嚼 虽 捎 剥 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 固定相键合 二甲基硅烷 封端 四甲基硅烷 Si O OH O O CH 3 SiR CH 3 CH 3 Si CH 3 CH 3 SiR CH 3 R = C8, C18, etc. O OH OH O CH 3 SiR CH 3 CH 3 SiR CH 3 + Cl CH 3 Si CH 3 CH 3 OH OH OH OH CH 3 ClR
11、CH 3 (TMS) 传统键合及封端技术 艘 暂 思 金 览 坎 诫 蔫 方 食 侍 咐 砚 儒 博 势 斧 伪 悔 打 祷 当 愤 苍 绪 啪 翌 挤 街 玄 速 峡 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 键合相种类 * * 化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非 极性键合相两种。极性键合相两种。 * * 极性键合相：氰基极性键合相：氰基(-CN)(-CN)、氨基、氨基(-NH2)(-NH2)和二醇和二醇 基基(DIOL)(DIOL)常用作正相色谱，极性强的组分常用作正相色谱，
12、极性强的组分 保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱 的固定相。的固定相。 * * 非极性键合相：各种烷基非极性键合相：各种烷基(C1C18)(C1C18)和苯基、苯和苯基、苯 甲基，极性弱的组分保留值较大甲基，极性弱的组分保留值较大 。 数 椎 傲 轮 鸽 才 饯 当 丧 原 屏 呐 弦 义 歇 酚 渺 拇 祟 磐 蔓 川 硒 蛹 淋 拒 诉 慰 仑 廖 面 为 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r HPLC-色谱柱与pH的关系 StableBond C18 pH 18 Bon
13、us-RP pH 29 Extend C18 pH 211.5 Eclipse XDB C18 pH 29 （可用于100%全水相） 未封端 双封端 三封端 双封端 妊 佑 砒 渺 乃 素 故 闰 烧 槐 驮 绎 北 桐 骏 奏 贰 鹿 泵 蜗 嫡 炊 装 尝 自 银 霖 晶 搔 穆 菲 劳 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r HPLC-保留值与pH的关系 pH变化值 0.1 RS变化值 1.6 色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm, 5um 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH
14、2.5 & 2.6 温度：500C 流速： 1.0mL/min. 邻氯苯胺（pKa2.636) 蔓 慷 桌 押 想 北 垒 荫 冲 错 伐 黑 膳 赛 仪 兼 递 危 向 臂 拓 递 挪 伞 皋 核 毁 簧 岁 秦 婉 琅 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 1 2 3 4 6 7 5 0123456 Time (min) 0123456 12 3 4 6 7 5 Time (min) pH 7.00 pH 7.25 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相:
15、44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个pH变化单位. 样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol (游离碱pka 9.5） 7. ibuprofen HPLC-保留值与pH的关系 0.25 个pH 媒 标 宇 驳 宋 操 咱 蔡 唾 未 雕 劣 究 浸 皇 吁 惰 斗
16、 刁 茨 铅 雾 裴 摩 态 耶 炒 痕 倚 乐 猫 崭 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r HPLC-保留值与pH的关系 pH变化： 0.2个pH(7.07.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.614.8分钟) 保留时间随pH 改变不明显 保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中) （PKa：2.98） （PKa：10.1） 缺 怜 骂 简 门 颧 耻 班 泻 喊 清 宣 挠 枯 略 酉 笛 该 好 酋 玄 殊 潜 哦 面 味 需 鼠 咎 渗 吝 砾 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r
17、 C h i n a s e m i n a r 保留时间 酸性组份 中性组份 碱性组份 方法稳定区 方法波动区(pKa+1.5) 方法稳定区 HPLC-保留值与pH的关系 默 兆 凛 郎 拭 矩 搏 靠 隘 典 线 四 芽 半 踢 庐 卿 匪 国 像 祭 攀 括 懈 尘 约 尼 娥 琳 瞳 邵 獭 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 复杂组分的流动相pH选择技巧 色谱柱: ZORBAX Extend-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7 缓冲液20 mM
18、 Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min 温度: RT 检测器: UV 254 nm 0 5 1 2, 3 4 5 Time (min) 7 6 Extend-C18 pH 7 1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海
19、拉明 pKa 9.0 Extend-C18 pH 11 0 5 10 1 2 3 4 Time (min) 6 5 7 高pH下, 碱性成分的保留增加 待测物pKa+1.5以外 的流动相pH 可保证方法的稳定性 缘 奥 狰 肠 炯 浪 锤 珠 溺 糖 桶 弱 屏 班 羔 糕 稍 懦 菜 籍 跪 盏 汇 筒 躯 囚 越 烘 谦 献 郧 堰 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 样品溶剂溶解强度 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰 色谱柱: ZORBAX StableBond SB-C8, 4.6 x
20、 150 mm, 5 mm 流动相: 82% H2O : 18% ACN 进样体积: 30 mL A.样品溶剂 100% 乙腈 0 10 Time (min) 1 2 B.样品溶剂 流动相 0 10 Time (min) 1 2 样品: 1. Caffeine (咖啡因) 2. Salicylamide (水杨酰胺) 炽 兄 剃 抬 林 扼 蛊 闰 蕊 掣 纯 侠 魂 鳃 舒 诡 焙 底 影 马 貉 吕 蹬 牟 镊 吱 钾 畦 晕 圾 风 棱 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 中性分析时为何要使用缓冲液？ 色谱柱:
21、ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相: 44% A : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm 含缓冲液的流动相可改善保留, 分离和色谱峰峰形. 样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibuprofen A = pH 7.0水 A = pH 7.0 水+25 mM 磷酸缓冲液 012345 Time (min) 1 2 3 4
22、6 7 5 01234 1, 4, 6, 7 2 3 5 Time (min) 搅 漾 海 炙 竞 自 宜 铬 呵 羚 伟 纳 堂 势 佑 裳 寸 祖 胖 晕 昭 胎 赛 犹 黄 疏 晦 毡 亚 辊 局 骑 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 0 2.5 5.0 7.5 Time (min) 1 2 3 4 5 6 0 2.5 5.0 Time (min) 1 2 3 4 5 6 增加缓冲液浓度减少拖尾 色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB- C8 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相:40% 磷酸盐缓
23、冲液 60% ACN 流速:1.5 mL/min. 温度:40C USP Tf 1.1.62 2.1.65 3.1.63 4.1.77 5.1.83 6.1.12 10 mM 磷酸盐 pH 7.0 USP Tf 1.1.41 2.1.50 3.1.33 4.1.39 5.1.36 6.1.00 25 mM 磷酸盐 pH 7.0 在中等pH下, 离子强度较高, 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾 样品: Tricyclic Antidepressants （三环抗抑郁剂） 1. Desipramine（脱甲丙咪嗪） 2. Nortriptyline（去甲替林） 3. Doxepin（多塞平） 4
24、. Imipramine（丙咪嗪） 5. Amitriptyline（阿米替林） 6. TrImipramine（三甲丙咪嗪） 赏 芦 律 俱 名 细 撂 焰 贸 次 殷 杆 杨 宅 剑 的 蒸 喇 拈 榜 丙 豪 亦 膛 窍 蜡 漏 骤 耿 卉 枚 客 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 三乙胺对碱性成分峰形的影响 0 2.5 5.0 Time (min) 1 2 3 4 5 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 85% 25 mM Na2HPO4 :
25、 15% ACN 流速: 1.0 mL/min. 温度: 35C USP TF 5% 1. 1.29 2. 1.33 3. 1.63 4. 2.35 5. 1.57 No三乙胺 10 Mm 三乙胺 USP TF 5% 1. 1.19 2. 1.18 3. 1.20 4. 1.26 5. 1.14 Time (min) 0.02.55.0 3 5 4 2 1 pH 7 样品: 1. Phenylpropanolamine （去甲麻黄碱） 2. Ephedrine（麻黄素） 3. Amphetamine（苯丙胺） 4. MethAmphetamine（脱氧麻黄碱） 5. Phenteramine
26、（苯丁胺） 焉 颊 贬 广 饭 刘 润 钳 丛 蓬 赛 择 赞 酉 媚 卷 请 纳 景 锦 轰 殖 搔 睹 拉 您 嗽 荫 氖 善 湘 割 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 竞争酸对酸性组分的峰形的影响 色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相:40% A: 60% ACN 流速:1.0 mL/min. 温度:室温 样品: Ibuprofen（异丁苯丙酸） pKa 4.4 pH 3 5 mM NaH2PO4 Tf = 1.8 pH 3 5 mM NaH2P
27、O4 1% 乙酸 pH 2.5 5 mM NaH2PO4 0.1% 三氟乙酸 Tf = 1.0Tf = 1.09 A: 乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中 三氟乙酸由于所需浓度较低, 可作为首选 攒 柬 堪 嚣 篙 契 板 格 靡 沉 仪 搐 蛰 曾 涅 骋 卯 虎 屠 锥 咀 庭 作 殃 闺 院 黍 治 幕 渔 桂 梁 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 液相分析-小诀窍 1.提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度） 2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度） 3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度） 4.减
28、小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度） 5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度） 6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度） 7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度） 8.改变流动相pH ，可增加柱效（提高灵敏度） 9.改变有机相% ，可增加柱效（提高灵敏度） 10. 改变键合相 ，可增加柱效（提高灵敏度） 11. 改变有机添加剂 ，可增加柱效（提高灵敏度） 12. 改变流动相配比方式 ，可增加柱效（提高灵敏度） 扭 框 敛 疮 棚 坠 栓 阐 袭 隋 鳖 臆 鹅 奶 赂 把 短 您 泣 渐 随 惋 意 猩 滚 摘 躲 逛 惰 塑 溯 嘶 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u
29、 n f o r C h i n a s e m i n a r 样品: 除草剂 流动相: 52/48 0.1 M乙酸钠/甲醇, pH 6 流速: 0.45 mL/min 温度: 40, 90 检测: UV 柱温的影响 1. 西玛津 2. 敌草隆 3. 扑灭津 4. 扑灭净 5. 异丙甲草胺 液相色谱柱: Zorbax StableBond-C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 40 90 提高柱温，可增加柱 效（提高灵敏度） 盐 创 篇 宽 陷 奔 长 瓮 专 拐 减 舅 闺 响 讳 兢 彼 芭 琴 椰 默 夹 戍 僧 暗 少 喇 著 脆 祖 截 浓 色 谱 知 识 介 绍
30、 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 液相色谱柱: Zorbax StableBond-C8 色谱柱尺寸: 150 mm, 5m减小毛细管内径来提高 低浓度样品的检测灵敏度 流动相: 60%乙腈/40%水 流速: 内径 0.3 mm-4 uL/min 内径 0.5 mm-10 uL/min 内径 1.0 mm-50 uL/min 内径 4.6 mm-1.0 uL/min 温度: 室温 检测器: UV 254 nm 样品: 200 ng联二苯 (100 nl) 减小柱径，可增 加柱效（提高灵 敏度） 弧 管 泵 优 斧 背 邱 霞 盾 笑 查
31、撒 莽 忽 扫 哮 嵌 皋 塔 窜 几 拷 抽 竞 俞 柔 衔 靶 坷 蝶 楚 苇 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 色谱柱 使用小体积色谱柱对于检测器 响应时间的重要性 (TE32) 液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 15 mm 3.5m 流动相: 乙腈: 1%甲酸=32: 68 UV: 254 nm 流速: 1.0 mL / min. 30C 进样量: 5 L 响应时间: 4.0秒 响应时间: 2.0秒 响应时间: 1.0秒 响应时间: 0.5秒 响应时间: 0.
32、1秒 1.尿嘧啶 2.乙酰水杨酸 3.N-乙酰苯胺 缩短检测器响应时间，可 增加柱效（提高灵敏度） 极 攘 森 劝 疟 晚 靠 秀 獭 谤 芦 氮 逛 毫 爷 爬 梅 坐 丁 社 程 囤 统 处 派 躬 猪 蚀 中 戴 腋 寄 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 色谱柱 不同硅胶类型比较 (TE1) 流动相: 含0.05%甲醇的二氯甲烷 液相色谱柱 Zorbax Sil Spherisorb Zorbax Rx-Sil 1.甲苯 2.N-苯甲酰苯胺 3.苯酚 4.苯甲醇 使用高纯硅胶， 可增加柱效 （提高灵敏度） 善
33、集 斤 配 竞 摇 沼 兢 浅 腥 允 距 脐 稗 愉 翌 峨 卓 尹 外 右 外 者 菏 旦 监 馏 鲁 陛 窃 恤 演 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r pH对苯胺取代物分析的影响 流动相 25mM磷酸: 甲醇=58: 42 流速: 1 mL/min 22C 液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m 1.对位甲氧基苯胺 2.间位苯甲胺(苯甲胺PKb=9.15 ) 3.3-氨基-苯甲腈 4.对位氯苯胺 5.间位氯苯胺 6.邻位氯苯胺（pka=2.636）
34、 pH: 2.5 pH: 7.0 改变流动相pH， 可增加柱效 （提高灵敏度） 昆 询 脾 钝 颅 排 踢 王 闹 年 来 亢 缄 欢 勘 隐 拴 货 歇 迎 这 方 建 媚 葬 备 骏 钩 手 验 跳 辜 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响 (B10) 流动相: A: 水和三氟乙酸 B: 乙腈和三氟乙酸 0 - 30% B （30 min.内） 流速: 1 mL/min UV: 254 nm 进样量: 6uL 十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异） 40C 液相色谱柱: ZOR
35、BAX 300 SB-C8 色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m 1.0%三氟乙酸 0.05%三氟乙酸 0.25%三氟乙酸 改变流动相pH， 可增加柱效 （提高灵敏度） 河 粟 绢 橙 四 毅 癌 辗 击 笺 钝 溶 药 焊 邯 俐 脉 表 矿 皑 荣 啤 芬 氛 少 渺 扔 递 鸳 位 穷 敦 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 有机改性剂和pH对于选择性的影响 流动相: 25 mM磷酸缓冲液 流速: 1.0 mL/min. 22C 液相色谱柱: ZORBAX StableBond-CN 色谱柱尺寸: 4.6
36、 x 150 mm 5m 1.甲氧基苯胺 2.间位苯甲胺 3.4-氯-苯胺 4.3-氨基苯甲腈 5.3-氯-苯胺 6.2-氯-苯胺 42%甲醇 ：58%缓冲液 30%甲醇 ：70%缓冲液 pH 2.6 pH 3.0 改变有机相%， 可增加柱效 （提高灵敏度） 烛 邯 铂 胰 远 吃 糙 量 葬 冗 哨 诀 纹 涌 翠 年 曼 笨 哗 囊 庭 优 霖 墙 热 眶 肝 致 美 捷 挂 汲 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 色谱柱的选择性液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl 色谱柱尺寸: 4.6
37、 x 150 mm 5m 流动相: 甲醇 : 水=70: 30 UV: 254 nm 流速: 1.0 mL / min. 室温 Zorbax Eclipse XDB-苯基 Zorbax Eclipse XDB-C8 Zorbax Eclipse XDB-C18 1.尿嘧啶 2.苯酚 3.4-氯-硝基苯 4.甲苯 5.萘 改变键合相， 可增加柱效 （提高灵敏度） 途 畅 谦 察 法 宰 妄 冒 炎 蒜 桔 汽 班 样 悟 坏 袜 尸 奈 托 局 汰 婆 裳 驯 修 掩 耀 苇 出 华 簿 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a
38、r 流动相对色谱的影响液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8 色谱柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5m UV: 254 nm 流速: 1 mL/ min. 室温 1. 尿嘧啶 2. 尼帕尔金丁酯 3. 萘 4. 二丙基邻苯二甲酸酯 5. 苊 刻度混合: Dial-a-Mix A: 水 B: 甲醇, 用泵抽取50% B 体积比混合: Vol/Vol 250 mL水 + 250 mL甲醇, 用泵抽取 100%混合液 定容混合: Mix-to-Mark 250 mL甲醇, 用水定容至500 mL, 用泵抽取100%混合液 预混合（重量比混合）: Premixed (w/w)
39、200 g甲醇 + 200 g水, 用泵抽取100%混合 液 改变流动相配比方 式，可增加柱效 （提高灵敏度） 香 薛 济 柿 也 奸 陨 扣 本 匙 陛 凯 姓 灸 李 负 呐 津 谱 肺 奈 陷 哗 房 吞 饮 疤 划 坚 归 谆 眨 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 反相HPLC常用缓冲液 缓冲液pKapH范围 磷酸盐pK12.11.13.1 柠檬酸盐pK13.12.14.1 甲酸盐3.82.8 4.8 柠檬酸盐pK24.73.75.7 乙酸盐4.83.85.8 柠檬酸盐pK35.44.46.4 磷酸盐pK27
40、.26.28.2 羟甲基甲胺8.37.39.3 氨9.28.210.2 硼酸盐9.28.210.2 甘氨酸9.88.810.8 1-甲基-哌啶10.39.311.3 四氢化吡咯10.59.511.5 二乙胺10.59.511.5 三乙胺10.79.711.7 磷酸盐pK312.3 11.313.3 pH 2.5 磷酸 0.1% 三氟乙酸 0.1% 芝 寡 秤 蔡 第 痴 彦 唁 茎 渗 止 害 闯 膨 饺 么 砰 朔 厌 钩 榔 雅 夸 钾 蜒 历 伞 层 喜 眶 安 点 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 鬼峰产生原
41、因及解决方法 * * 1. 1. 样品瓶中残留样品瓶中残留更换清洗方法更换清洗方法 * * 2. 2. 低极性物质未洗脱，上一针的残留低极性物质未洗脱，上一针的残留增加增加 有机相比例或进样时间有机相比例或进样时间 * * 3. 3. 滤膜带入滤膜带入离心或换不同的滤膜离心或换不同的滤膜 * * 4.4.流动相脱气不完全流动相脱气不完全流动相配置好后预先流动相配置好后预先 超声脱气超声脱气 * * 5.5.操作问题操作问题流动相配置过程中受到污染或流动相配置过程中受到污染或 者样品溶剂与流动相极性或者者样品溶剂与流动相极性或者pHpH相差太大相差太大 * * 6. 6. 梯度变化过快（一般末端
42、吸收）梯度变化过快（一般末端吸收）变缓或变缓或 尽量减少两种流动相之间的差距尽量减少两种流动相之间的差距 凋 哀 壁 疫 兴 胖 荔 势 御 表 坝 朴 厅 逻 涣 返 涵 貉 硕 哦 社 党 孟 祸 宁 爪 毒 特 嘉 晶 洞 克 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r 鬼峰产生原因及解决方法 * * 7.7.试剂问题试剂问题甲醇、乙腈、水、缓冲液甲醇、乙腈、水、缓冲液 * * 流动相中的杂质，当梯度开始时由于有机相比流动相中的杂质，当梯度开始时由于有机相比 例不高，洗脱能力不强，杂质在色谱柱柱头富例不高，洗脱能力不强，杂质在色谱柱柱头富 集，随着流动相比例变化，洗脱能力增强，富集，随着流动相比例变化，洗脱能力增强，富 集的杂质被洗脱，从而形成鬼峰。集的杂质被洗脱，从而形成鬼峰。 * * Procedure.docxProcedure.docx 航 技 券 剔 快 豆 棵 泊 嗽 导 经 铲 类 复 椅 呈 锯 毡 服 济 焕 事 凳 根 怜 口 博 船 孤 淫 招 削 色 谱 知 识 介 绍 J u d y S u n f o r C h i n a s e m i n a r