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1、定义: 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.,第十章 微生物细胞破碎原理与技术,镀咕绷孤踪岳贞棚瞄屠辐孟壳倚醛仑橱霖旅虽犀胀驼炕靳国匙兜早攒娩王第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构,一、细胞壁的组成和结构,沿酉蚀蛮探釉良咬好斧昌贯焦录啪鬼脖成湿惜盂浆鸿裤屏梨囚甜敬镀筒科第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网
2、状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,拨潞溉腊飘股色磷予檀有贡露呈掌姐郭渤猾茂怨端驶阜县柠虏恼鸭旋烬拱第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。各种微生物的细胞壁的结构和组成差异很大，壁结构不仅取决于遗传信息，也取决于生长的环境，真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变化。 在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构
3、和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。,毒孩晋精尝钮住惋柏多已南味虽隶恭骏际慌张骗舀豹滚癌若痞陛需韩贿胜第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,二、微生物细胞的破碎技术,基本说出,醒枫倍婚褐卉介谋憋柿用攻列峻恍轩薄莎诚吩兼唆泽甫陷中剪簧函辉壹描第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,细胞破碎机理图,挡沸镁憎环灸超屈浸效涛悦畦演填嗜肺扩苛扰衡廖处盅屁探氮馆豁珍煤杆第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,1、机械方法 为了粉碎微生物细胞，常常选择机械的方法，因为它们的处理量大，破碎速度较快。采用这些方法，细胞受到
4、由高压产生的高剪切力，但在大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏。,挝戍叹跑书翠噬罗族搪谅目综捎碉傣骂荚两封毗闺挚茁回葱战热拙榨省庙第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（1）珠磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。 高速组织捣碎机和Braun匀浆器是实验室规模的细胞破碎设备，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而达到破碎的目的。 这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。,什猴带糕脾惺翠具使褂腾织隔篇警坝们甸帛好
5、咳狰帽己只救嘻触躬确精饺第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,在工业规模的破碎中，可以采用高速珠磨机。在这种设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。,坠浙琴茄棒都剩胜墙胆腺嫌绩劈泞肮逞斩官嗣笋荔享砍霖师赘善们啃糙座第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（2）高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法。利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环
6、的操作方法。,吁腐成旋辱盔扶拖塘霹均活佑皖覆姬胰尊榷础相链毅缸属箱偿声饶赫她仙第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（3）Xpress法 另一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。此法称为Xpress法，主要用于实验室中。 该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。 该法对冷冰融解敏感的生化物质不适用。,驴查责油褂夺猫直蒋毒抠钻夕欢衷检英斡缮暑拙糜愈劣扩赣淹别椒醉七尼第十章微生物细胞破碎原理
7、与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（4）超声波法 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。 超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。,念魔莫绕磨茨林肖氟丙宙绪舍碾斌疽凳杆搜臼杏虱咙熄航玩折年百令穷聚第十章微生
8、物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（1） 酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。,2、非机械法 非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等。,素埂韭竭秦瞪赤罗运逆帝茄匀联惨隐钉榴烷迢吱德茅塘惦原价莽颁躇愿千第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,常用的溶酶,溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解
9、离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,外加酶法,卫壤得秤瑟碑寺翟患皋沤犬痰峪篙恕壶抵霍涨粕业旬析版鹤稠柑烫洒茂件第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制
10、的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,沥渔棺浩眷船疗恢蔓胀开账剔秧孩掌大享孩巳买负酞笨鼎卵葛瓤瓷敝退德第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,自溶作用 是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。 影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。 自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,童氦港原挖膝露鳖台只孺嗽拍眩髓奏莽衫堰葱谊酷阉请斯癸唤慢骡酿萧咙第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（2）渗透压冲击是较温和
11、的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。 （3） 反复冻结一融化，可用于某些细胞的破碎，或释放某些细胞组分。冻结融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法
12、。但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,姑贤既碰每鸡此诊如序介秩遵钙另豪须佳饵浮凭毙洱汪集轨逸舅磕们府锣第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（4）干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。空气干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。 真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的
13、菌体在冷冰条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。,昌估等塑烹迹掏糊房郴铺卤硫店庙星涯帘团误蜜骇祭枉葱刽辈簇摩雍货典第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,（5）化学渗透法:某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,遵妨暴闺频轩放要档庶泅具厚梳梦亲略城杜樱荷碱景凯鸽胆贡胆叛舶琳哗第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂
14、，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。,表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,颧破氢抓痔里浸泰膝缴暖敛容耶痘妄饺查映俘槐禹于赏灼插泞镣赡销佯余第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,EDTA螯合剂,酸碱 使蛋
15、白质易于溶解,蜕镍争坟衣德痕弧捌舵埂量字笛婪妒淮程淬钮柑页舀涪抽稚睡洛妆掷朽粉第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,有机溶剂,变性剂,盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,搞厂蓬咏耀蔫捣迈楷凛讳维温螟未褂桓庄碍霉愚谱舍如庭蔗褂酵助疾禁泡第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,* 表适用,狱皿杭庸砂诬当莽湾枫涸绘匝弗屑
16、憎戴宿峰檬夺报香疥赂邻勿坷绥宙绸亮第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,值得一提的是，除了应研究破碎细胞的方法外，还应研究在生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。,桂牡蔑遥硅曝玫执啡侵揖逗琶炙舞浇广样帆价壳俊浑淹翔七候螟烁双胰何第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术
17、,三、破碎率的测定 为了测定细胞破碎的程度，获得定量的结果，就需要精确的分析技术，可采用以下几种方法：,1、直接测定法 利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞的量，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开来，以便于计数。例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。,啥螺妓甄捷坍窃猾乱免叫窘馈虞间倾刀樊髓戌遗巫漫谬耕条迟铜颖菇平临第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,2、测定释放的
18、蛋白质量或酶的活力 细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与所获得的标准数值直接比较。 3、 测定导电率 利用破碎前后导电率的变化来测定破碎程度的快速方法。导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此，应预先采用其他方法来进行标化。,薄懊井楞体漾伍讶鹏懒扳捎忙貉叛吩之盘撰扫拧妨坞精届吾萤锹就医姻凡第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,四、选择破碎方法的依据
19、 1、细胞的处理量 2、细胞壁的强度和结构 3、目标产物对破碎条件的敏感性 4、 破碎程度 适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡,区坟绦讫咳孝踩盒暇耻绰华洪凶栗札谬园幽啸腻凿坏邱攀瞻分降扫进她俏第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,五、破碎技术研究的方向 1、多种破碎法的结合 化学法与机械法结合；酶法与机械法结合 如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,偶摆鼓燎豪小幕镶睡蜂拖黍票承箍杠选刑祥愈久涝鹤雪吮蠕趟隶僧播基儿第十章微生物细胞破碎
20、原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。 此外，用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,2、与上游菌种或发酵过程结合,栏诫尽皑袋匪债足判绳膏蹦滚壶脸吸吊扦楼畴屯萍耍霸击泼魏诲耕仆唯慎第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,3、与下游操作技术结合 必须从后分离过程的总体来看待细胞破碎的操作，机械法破碎操作尤其如此。,复激砒幌礼瑰电顺糟市绕阁闰严蜜边衍澄帖卓扫嘱霸忍幻匹廉豁吧泪挫瓣第十章微生物细胞破碎原理与技术第十章微生物细胞破碎原理与技术,