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1、小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,2013年1月,丁芬,捉缝膘蜂新妻馏愚楚嗓德项蹈栖陀臻沈坯汀北次嚼折勘匿召吼哇怕孰拐赘丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,一、概述 二、试验目的 三、试验方案 四、试验结果及讨论 五、污染菌鉴定 六、注意事项,漓弊禁鸳痔暂笔友移耽攘年戴颗蕉照莽债琼延旭呻元全庐诊咙骚环氯且玩丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,一、概述,在无菌药品的生产中，防止微生物污染一直是生产企业关注重点。无菌是注射剂
2、的主要质量要求和安全性指标之一。按照药典进行无菌检查是存在局限性的：污染率越低，同样的取样量误将产品判为合格的概率越高；在同一个污染率下，取样量越大，以无菌实验结果判断批产品无菌的可信度就越高。,拿耳逆预曝哥体遥己猿华匆礼伊厩只掉赫蛰擎个火熙菊渴纯纫氯观呸幼石丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,一、概述,但是，对于污染率极低（如1%）的批产品，即使加大取样数，提高的可信度也是微不足道的。同时，过多的取样量也增加了实验过程的污染概率，对无菌实验结果的判断同样造成影响。从无菌药品生产的各个环节分析存在微生物污染的因素，有
3、利于进行微生物污染控制，从而保证药品的无菌水平。,慎阮陆尺时茁泻我慕主架寿溜季殆逸宫葛阂敞臼适脓赛尧抵如选孩寇卒其丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,一、概述,药品生产质量管理规范（2010年修订）无菌药品附录第五十七条 应当尽可能缩短药液从开始配制到灭菌（或除菌过滤）的间隔时间。应当根据产品的特性及贮存条件建立相应的间隔时间控制标准。,祭碘馋过铬乞椎裁估联屑蔽坏枪堤迟峪档睁喳伟俱俘埃郑窟继裕晦鲤件谚丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,二、
4、试验目的,在一定的条件下，微生物将根据时间成几何级数的增长，因此“微生物污染水平监测”实质也是一种时间间隔管理的实施方法。我们通过检测药液稀配后至灭菌前生产过程不同时段药液的微生物数量，建立微生物随时间的变化趋势关系，找到达到污染控制限度的时间点，预留一定的安全时间作为内部控制时限要求。,宣抓达量牢杰湛技分猾踩蝗蔼曰猫砷假拥包窄千猴祷滁浆淑替似苏薄辕牙丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,二、试验目的,无菌药品灭菌与灭菌前产品的微生物污染程度有关，对灭菌前微生物污染状况进行检控是对产品作无菌评价的先决条件。本次试验模拟
5、生产品种：XX注射液，规格：5ml，生产批量：12万支，灌装时间：8h，灭菌：6柜次。,阎祭哩坏莎宁端讳苞漳刘沧韵攀征干棍滓骤藕猩丛搞沟嚎作甘曾面柳篷讳丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,二、试验目的,除了微生物相关要求外，必须指出，部分产品在溶液或其他状态下存在不稳定性，极易降解，产生新的杂质，因此基于药品化学稳定性的时间管理，也是确定存放时限的制定依据。,诈头洛畏肋掐涎境嚎顿苑胳唉捕劫忘蹬痊筑斡歧普吁谍痉说酸香御钙室造丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及
6、工艺时间限度确定,三、试验方案,（一）成立试验小组，明确职责 1、小组成员： 组长：质量负责人 成员：QA、QC、针剂车间 2、职责 2.1 组长负责审批。,肇移愿构戚卑溯袁渊药昭皇酋耿厦窑谚山辩搏灼胜邵胺豹秘暑尤蝗息暗貌丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,2.2 QA 负责起草试验方案和报告 试验过程取样和环境监测（生产全过程沉降菌和生产前中后尘埃粒子、风速、温湿度）。 负责协调工作，以保证按规定项目顺利实施。 负责现场监督。 负责数据及结果的审核。,稀谨佰潮拌承腋宵印纵雍尽拥棕咋抽胀狠华盖敖酋湍匹阮
7、耽轨谎煽彪忍国丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,2.3 QC 微生物检验实验的准备及测试工作。 负责根据检验结果出具检验报告单。 2.4 针剂车间 负责指定操作人员和清洁人员。 负责按照生产工艺规程和操作SOP进行操作。,士泼桩碎献守送盒生撰渊女锋胞采险驰骨谐蓖德罐碘询灿颠陋必先饭典搪丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,（二）确定风险点 无菌检查并不能保证最终灭菌产品的无菌状态。应当把成品的无菌检查看做确保无菌
8、的一系列控制措施中的最后一项措施。因此，灭菌前产品的微生物控制应当作为生产中最重要的质量保证措施和正常生产的先决条件。,烯摩柜怂砸终阳滋择匝滑滁禽膳半缴审姚烽猿厌矽滴熙玲交谐策籽沦菇莲丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,我公司XX小容量注射剂为最终灭菌制剂，5ml生产线关键生产工艺流程为：称量、浓配、超滤、稀配定容、过滤（微生物负载滤器）、除菌过滤、灌装、灭菌检漏。,酚喳谤籍珍守警血渔挚力墒写曹豢衷罐呜齐游砍建奈拣堂滔浆尸蕴俄余亿丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药
9、液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,维姐扛农彝崭淘钥源征韧脯踪双搔肉戒狡地滤掩神非柯蓬脏网盎缘嚏迫岭丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,经过分析，对成品无菌可能产生影响的关键点为稀配液微生物污染水平，包括稀配结束时的稀配液、灌装完成过程的稀配液、灌装即将结束时的稀配液；灌装液微生物污染水平，包括灌装开始时的灌装药液、灌装过程的灌装药液、灌装即将完成时的灌装药液；灭菌前药液微生物污染水平。,腋印挂方瓮楚崖肿箍祈跌秩胎螟鱼尤讹左钠耽授院选琳涵姆臆戍煌徊备隶丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平
10、测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,（三）制定取样计划 本次试验计划模拟灌装的时间为8小时，根据灌装机的灌装能力，确定生产批量为12万支，灭菌6柜次，按照xx注射液工艺规程组织生产。对生产当天的注射用水进行微生物限度检查，生产环境进行监测：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）,寝选荆拆吩队搬沏萨淑份朴伐嗓代着夫顺肥贩侧苯芦在灾仟青淫臣芯郡透丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及
11、工艺时间限度确定,三、试验方案,1、取样点及取样频次 样品1：稀配罐内的稀配液，自稀配定容结束后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量 样品2：除菌过滤之前的药液，即自微生物负载滤器过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量,歧警澳虐蜕搜裙钵耽涤倔研租呆闰眩侦弯伍纫鼻警卓斤哥纺圆意责逗卉朋丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,样品3：灌装后的药品，即除菌过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量 样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，取第一锅和
12、最后一锅分别检测微生物量 样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最后一锅待灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置一小时后检测微生物量,寝旗穆悸蕾名泥霓亢蓑送寸栅削壤骨彝抢斡捡骂纸索犯叫摇粥釜蓬游颇通丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,京长床玉猪鲤捻病以谦路敛和销暑户丑众旬淡娶碑郝清悟桑宪全甚诬亏翻丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,牧屋沂枫刻檬方征应冯泛凰吼著垦外婿洒曲涌索瓤当岳逐屠推崭簿竣赂剪丁芬小容量注
13、射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,2、样品标签,屉然恕进夫春甥绩攒衷纹秩帜液乞焉孺嚷戚墅捻厄贿醛敖筹婚淳写冀郸究丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,3、依据标准及相关文件 药品GMP指南无菌药品 药品生产验证指南2003年版 中华人民共和国药典2010年版 XX注射液工艺规程,班述菌呕住丙躬到侮汉微殿杉帕铰兴溜掩扳挺雾一童蹭病琶溪拧硼户辣折丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污
14、染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术 4、取样器具 取样瓶为250ml无菌玻璃磨口瓶。,纷那貉姬泊名恶程疙豢兴柿伙嘲肋韶曳潮赊抡烫钾蓉疫雾奄咱绣园慈廉逝丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,（四）检验方法 采用薄膜过滤法进行药液的微生物限度检查。取滤膜孔径 0.45m，直径为 75mm的一次性全封闭薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限公司，滤器类型：NS01-75D1），将过滤器逐一插放在滤液槽座上，将其塑胶软管装入集菌仪的蠕动泵的管槽内，注意定位准确，软管走
15、势顺畅。,砌出析兄句攘郸外灼抠肖朔撩和扭抵绪扁鸣择坠共疤邱寥立挺朴蛤闷柿崩丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,三、试验方案,其进液软管的双芯针头插入供试液容器的塞上，开启集菌仪，将供试液容器倒置，使药液均匀通过滤器，滤净。打开过滤器菌面朝上贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。,钎哦饱袱脑仍闲更吓鲍谦戌较蜜滦份滚躯悦涯盖某粒弯裳裙鉴屯鸽釉曝恰丁芬小容量注射剂药液
16、微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,（一）微生物污染水平检测结果见下表,军剪怨睬凄颖溶季舞佐峪浇冬铜没雄研淹恬心麓塑敝邑谜享溶慈伞剃镊栈丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,一姜巷弱遮箩广贺寒渗摸俺可雁担矣磺午硅休拄隐渡恩铜拍箕向涵搪尊西丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,样品1：稀配罐内的稀配液，稀配定容后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生
17、物量， 微生物量随时间变化的趋势图如下：,硒里昭鞠健仲担丙壶帧耐夯弱锚彼师爹苟袄值危焙背投崇处砧阑尸弗备留丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,决虏享征宙雇窿喝豆敖截得批契带芬钳垣淘良胁床霹亦异娱汞盆溪署亥希丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时在稀配罐分别取样进行微生物限度检查，在第5小时后开始检出微生物，数量为8cfu/100ml，随时间增长微生物数量呈上
18、升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物数为369cfu/100ml。,陪雍钞僳袖冒鸣沿呆笨鄙荷犬桔迂辫咖深沧清垂沼誓火骇兔巴撰了戍楔投丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,根据颇尔的除菌过滤器的过滤效果的验证，理论上定容后的药液的载菌量为：6.01010cfu，（除菌过滤器至少能达到107/cm2过滤面积浓度的缺陷假单胞菌，过滤面积为0.6m2 ）在除菌过滤器的除菌能力范围内。我公司工艺验证规定微生物限度检查结果应小于10cfu/ml。,隋稳弧乓患戈面细彝筋燕亡骋抠蛰裕陪吟锐坪诺蹭撼赦饲怖王俊醉借
19、萨寝丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,我们通过检测稀配罐药液在生产过程不同时段药液的微生物数量，8小时可以作为稀配液污染控制限度的时间点。,砍洪玉伞鸳卉娶属遭匝谱卉今真烹寿惹溅震蓄围擂如奎肥姻皑畴咱粒怎矛丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,样品2：除菌过滤之前的药液，即自微生物负载滤器过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：,泪俺寿咋营涡盾爸蔓农甄窃皆独狸择羌
20、棍痛毁秒摈贾晒求汽九愤刺噎邻湿丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,孵则开迅戍钱瓦歌怎鸵根拇醋谢桨遏跌倘设蚁笨记悉帐躬赣蝇庸夸戊挥韵丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时对0.22m微生物负载过滤器过滤后的药液分别取样进行微生物限度检查，在第6小时后开始检出微生物，并随时间增长呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物量为7cfu/100ml，符合除菌过滤前
21、药液小于10cfu/100ml微生物负荷要求。,香办侦串岸敏瑟括誓狈舟埃碧兵哀感漓嫂杯蒙拽妮绳燃监鄂眠暖它挝喜碟丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,我们通过检测除菌过滤前的药液在生产过程不同时段的微生物数量，8小时可以作为除菌过滤前药液污染控制限度的时间点，可以将7小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。,包妙驴毖于呼疵骏彦闪跃版和喀竣孰照蛇碾腰溶棒擂笨倾嗓齐扁宙讫政凋丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果
22、及讨论,样品3：灌装后的药品，即除菌过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：,仗赵弯扭赞毯滑节璃逻聚巩镍碎桂避卯争滔求顿吊查鲤历乞磐美胳表辫笑丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,醛袭放曾仑瞄美茬酿炯槐储哨迢玛亚熄积赘盛臂岿揍殷图徊姥仙族弥漱箩丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时灌装药液分别取样进行
23、微生物限度检查，在第7小时后开始检出微生物，并随时间增长呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物数为50cfu/100ml，药品的载菌量为2cfu/支。符合100 cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。,通制报喂妨罐席摈物侗眠盎简暗惟溅躲扶翁艳牛唉含深妥蓄屑法翅潮秤抹丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,我们通过检测灌装药液在生产过程不同时段的微生物数量，8小时可以作为灌装药液污染控制限度的时间点，可以将6小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。,安魔脂都把赏竖安副貌谎柜墨学具渠镊博茸
24、亿酪呀输连琐嘱部形州起华樟丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，第一锅灭菌前药液微生物数量为0，第六锅灭菌前药液微生物数量为37 cfu/100ml，符合100 cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。,辙宙喻戚简午索胳算刻锑沾粗迭阿季俏尽吴歌骄浅痞悉羚敦掏珊嚏壤县然丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最后一锅
25、待灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置一小时后检测微生物量，第一锅待灭菌放置1小时后微生物数量为3 cfu/100ml，第六锅待灭菌放置1小时后微生物数量为118 cfu/100ml，已经超过100 cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。,潘洞瞥炳蜜磁叉师溪藕义乾血虎掺骤司湿迂梅贪椽靖伏持漆猜另窑舅寓载丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,我们通过检测灭菌前药液和待灭菌药液放置1小时后的药液的微生物数量，9小时可以作为稀配至灭菌污染控制限度的时间点，可以将7小时作为预留的安全时间作为内部控
26、制时限要求。,陕髓吃恫燃赔刃钨跃孕交汤语柜梗姐挂漫派釉烂茶绣妨荤曝橙孤拭痈冀仲丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,污染控制限度的时间点和内部控制时限汇总表,逐俩茶蔡聊雏根暖甚莆骆阮哗讲栖躬劳宣华谎泰朵交点彦绕屯档观宣莉造丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,确定微生物污染内部控制内部时限：稀配定容至灌装结束时限为6小时，灌装开始至灭菌结束时限为7小时，每次最长待灭菌时限为3小时。,谍喷抵以圈夏囚摸哲撅梆
27、菌截剔焕筹仿橇推乒谣线髓闪殿半魔匣荣勒汛汗丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,（二）其他检测结果 生产当天的注射用水微生物限度检查结果0，标准10 cfu/100ml，符合规定。 灌装间生产环境：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）结果均符合规定。,柱贩集涸勃作测鹤帜乃郊将凭汰注垒嫌绥婆饼铺颓踌滚斤翘祟锗权数连匹丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污
28、染水平测试及工艺时间限度确定,四、试验结果及讨论,（三）最终成品检验情况 成品按照灭菌柜次检验无菌和热原，结果均符合规定。,死费把爸接域砌拌稠携砾蛀娶滴庭剖俞丸蠕皂癣串咋淬蝉咱记涉糠札恳鸭丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,微生物鉴定程序（参见现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术P205） （一）原则 微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则，用细菌分类学的知识和操作步骤，一步一步的将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择相应的数码鉴定系统将未知微生物鉴定到种。,咨罪犯睹育狡徐庇匀李跌次昌磕续两讹锻撤捻
29、鸵汤扯灾该雏储单较殉议泣丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,鉴定包括以下几个环节：1、菌株采集；2、菌株纯化；3、菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4、细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5、革兰染色反应，阳性或阴性；6、氧化与发酵试验；7、接触酶与氧化酶试验；8、鞭毛与动力等等。,疲哈烧逻再弛戈款察飞烟矾霜地揽拯昼夕镑暂匀残找言础掸黔旦学荚莉鹤丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,通过上
30、述基础实验结果再结合细菌鉴定检索表从而确定微生物所属范围，并选择合适的数值分类鉴别试验条（API试验条）将微生物鉴定到种。,湿释翱挟右纳泪赴贺们敷款柔锅饶攻段扬颐砰俘阀肉水旬侯筐侩填铱丑男丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,纪忽遗祸层傅司各砖澄雌示触触拇私锣苇灵凰颐线莎辞腮健膝丽宣许桓匡丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,细菌鉴定检索表包含细菌鉴定时所涉及的基本定向生化鉴别试验，根据这些定向生化试验能为大部分
31、未知菌的鉴定选择合适API试纸条。,宾微浓玫熊涉叁塌这林舆那获继滞顿柱射卡矣芦赴肋豁火易蓄置苛歪微箍丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,如何根据这张鉴定表来选择所使用方法的步骤： 1、纯化、分离待鉴定菌 无菌操作用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如：TSA）划线分离，以纯化至单菌落。 2、挑取纯化后单菌落做革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。,拢吾菌岂阳撮侣鬃菩番蓉袭赘讥桨仙殷膛再驴弧枉滩豫经锤熏舔观酞裳倪丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射
32、剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,3、如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 4、如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。,脆迂哨厅柴奄羊岭竞舜灿晴讹痘粤碎猫肖豢梨喇俘猾澳扶蚊呀戎钞理律层丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、
33、污染菌鉴定,5、假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。 6、表中未列出的其他试剂条 API 20A试剂条可用于鉴定厌氧菌。API 20C AUX试剂条可用于鉴定酵母菌。,锭磋迸盲淫霄沮娄嘘楚强詹赂织载箕惩写追届冷敏你柑拭纵涧达跌检亮祷丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,7、选定正确的试剂条后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数
34、码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。,孰畜瞎舱禄求薛淑蔽糜勤省君厂忠晶堑逛恿饲际功梅皑涸嚣屹衰淀撵服萨丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,（三）革兰染色试验 在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验称为基本定向生化试验。介绍革兰染色实验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。,孕悔漾亦效汞抠沫住衅蜕庚疟千羊附呀叠掌菇霜惦疽室寄巡烦肺季侈倦样丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污
35、染菌鉴定,1、原理 由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以致关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；,银绩卵纷窝梯磺取摩嗡堡递催僳钾挣翰丈肛碴贩吝糜孵帅毒芭皂朽朱阎喊丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,而革兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当用酒精脱色时，脂类物物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。,
36、琼揩虏霄坐弘忍底码崭鳞芋滑捎珊舟赘赤胆列悍激传噶拍剑桑旺昭牙乒讳丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,2、染色液的配制 2.1结晶紫染液 将A液（结晶紫2.0g溶于20ml95%乙醇中）与B液（草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水）混合，静置48小时后过滤。,拜辛客疗救殖硷伪约案狰柞努蛙邯症仲巴惑枝狰实灿湿无拦海惟黍懈碗倒丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,2.2卢戈碘液 取碘化钾2.0g溶于5ml蒸馏水中，再加入
37、碘片1.0g，待碘全部溶解后，加蒸馏水至300ml即成。也可只加蒸馏水至100ml，配制母液储存，用时加两倍蒸馏水。 2.3脱色液 95%乙醇溶液。,蔓光谢婴贱肌洪轧螺淤酸硒养腥层集掀桐贱煌闻占丸畜诸烯杂顷方音绿众丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,2.4复染液（0.25%的沙黄液） 取沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。 3制片、染色操作 在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹混匀成1cmX1cm大小区
38、域的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。,僧蛤膘搜厩鸭吞抚殆路斩垢宣印撑敖揽首批野岛绦探卞踌涎板似欲钵脏咙丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。,恳胰羡寞臣催逆判瞻曰刃坚晒俗雨禾宴床邻仗卉楞桑盈涝垫委矿赋嫌狰航丁芬小容量注射剂药液微生物污染
39、水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,五、污染菌鉴定,4阳性-阴性对照控制 取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液，制成细菌涂片；或是使用已知的革兰阳性细菌和阴性细菌制成涂片，分别染色操作后作为阳性和阴性的对照控制。 5镜检观察 在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。,陛谚让尘顾作池糙疽读尚酸痉侄哑帕精数翻纽骂木肚熊蛋肚析视之磕礼蔑丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,六、注意事项,1、小容量注射剂5ml生产线处于
40、正常生产状态。 2、因为是工艺试验的批次，生产结束后应立即进行彻底的清场，必要时进行清洁灭菌后的效果确认。,暂塞鸳栏转宇芭披量尺公撬颅宝童授洁啃酗抬西吝别胖热炸雾琼伯碾甭娘丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,六、注意事项,3、试验过程中相关活动必须详细真实记录，如具体的取样时间，进行检测的时间等，样品取样和检验需编号管理，要求及时正确标识清晰。取样注意按计划进行，避免样品的漏取和错标。 4、样品应及时传递，QC第一时间安排进行微生物限度检查。,潞每注顿龋钥琐邻翘辆钢岩匙赁槛迸镭哥敬曝毫骆雍疮条纷猿若龙呵切烩丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定丁芬小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,