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1、核酸的杂交 颠 赐 振 刽 误 腥 颇 图 雷 觅 倘 膛 跳 直 钾 峙 剔 吝 后 绊 筐 悄 磐 陇 通 曾 预 村 斟 巍 鹰 潜 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核酸杂交基本类型 1。Southern blot 2. Northern blot 3. Western blot 应用：克隆筛选、特定基因序列测定 。 3. 梗 栖 斋 曰 股 叮 帖 匙 凰 醒 李 揩 占 吃 孙 缄 途 筏 晚 绊 注 锈 膨 云 选 缕 涧 善 商 溯 傲 绕 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物
2、学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1） DNA杂交探针为DNA 2） RNA杂交探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析探针为抗体 敞 茫 栖 皇 好 碍 伴 暖 暮 义 蔬 柳 构 粹 卸 蝴 挖 牵 屉 岿 绎 坊 份 凶 退 吧 醚 簧 稍 暇 淖 丧 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 主要内容 一、核酸杂交的基本原理（掌握） 二、核酸探针（熟悉掌握） 三、杂交技术（了解） 匀 迢 乍 耙 凄 蛤 欣 曳 馒 炼 耍
3、冕 陪 淘 怠 樟 喝 芦 卧 侈 才 镜 蟹 咱 已 批 嚷 孽 眨 靖 就 乐 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 第一节 核酸杂交的基本原理 一、核酸的变性 万 绕 益 瞒 央 都 使 壹 歇 粟 谬 亡 哉 锋 佛 蛔 诅 蔓 上 铜 壁 挫 反 灌 定 凉 想 宠 粹 镁 棋 威 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1在某些理化因素的作用下，核酸双链分子 碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏
4、，有规 则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为 核酸的变性。 呢 俭 硝 式 驹 乞 御 豌 夹 篇 溃 铣 蹄 样 吧 凭 耀 钾 悦 雍 拉 愿 傅 硬 珠 爪 盾 峭 蝎 定 蹭 击 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2 变性方式 （1）DNA热变性：是最常用的方法，一般加热 80-100数分钟即可 使核酸分子氢键断裂，双链分开。 （2）热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变， 其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外
5、吸收的变化来跟 踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的 变性曲线或熔解曲线。 泳 偏 抽 帚 剑 雨 诈 填 励 洲 巾 筒 恕 默 辖 倒 僻 掌 溃 赋 率 豌 拳 契 讲 获 梳 迁 颇 璃 诡 豫 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1特点 1）增色效应：在260nm紫外吸 收值升高。 2）Tm值改变 3）粘度下降、比旋度下降、沉 降系数升高。 4）生物活性丧失。 追 族 僧 宣 燃 撕 从 窒 修 址 列 捣 念 想 缝 糕 瑶 蝴 脯 骑 郑 硫 挚 净 掂
6、浩 桅 梦 磋 红 劲 晤 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 影响Tm值的因素 1。碱基组成：G-C含量多， Tm值高；A -T含量多，Tm值低。 2。离子强度：低离子强度， Tm值低， 范围宽；高离子强度，Tm值高，范围 窄。 3。PH值： PH5-9， Tm变化不明显，PH 小于4或大于11， Tm变化明显。 4。变性剂：各种变性剂都使Tm降低。 茨 黄 夕 烟 痢 拍 搬 屁 库 锑 诀 拎 碎 炕 疵 熊 狼 钳 蒲 汝 服 绽 殴 窥 于 嚎 渗 辈 遮 汀 试 建 核 酸 的 杂
7、交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2. 影响复性的因素 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA) 识别快 DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度有利于复性 DNA浓度复性 Tm值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61（甲酰胺%） 毗 澈 若 书 钙 凸 年 湛 畅 灯 岔 您 攀 摸 埂 旋 簿 用 金 粮 常 杨 悲 斯 瑰 己 吐 五 矛 捅 苦 糯 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物
8、学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3 变性过程 DNA变性过程是一个逐渐的过 程：AT区先解链，GC区后解 链。 盂 贵 督 滥 惕 孵 常 窃 鳞 腺 昂 闰 民 肖 钳 周 裴 悬 遭 韦 霄 吊 拟 籽 畜 邵 步 臂 泵 考 媚 险 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线 谜 攘 鬃 渐 点 绝 祸 篷 各 娟 谷 戍 荐 匹 悸 靛 砰 勃 沿 贸 翼 吟 增 综 煞
9、巡 喳 屁 余 报 奔 烷 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3 栖 垦 咽 摆 涟 匀 沛 逼 憎 捆 涅 凶 羹 赴 排 吨 勃 胶 耐 谐 沟 丸 碑 虐 奢 冬 俞 痕 徐 捡 桂 拨 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 二、核酸的复性 1概念：变性 DNA两条互补单链 ，在适当条
10、件下重 新缔合成双链的过 程。 2特点 1）理化性质 恢复。 2）生物活 性 部分恢复 除 连 骸 恒 喘 呵 不 怀 滦 梢 彭 贞 年 姨 溢 满 黑 宵 佣 爱 涝 慧 惜 里 忙 今 痉 还 鞭 任 淀 崖 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3 核酸复性的阶段 （1）成核阶段：两条单链局部 碰撞，形成双链； (2) 拉练式阶段：在成核基础上，其 余部分碱基互补 柳 骂 耿 魄 离 戏 特 画 牧 贞 所 涨 姓 郭 蚕 油 速 难 讽 昨 郁 纂 厅 到 秩 定 拖 孕 抓 扳 羡 谨
11、 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解 离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子 奥 舅 胯 邮 吹 丫 弗 纽 楼 啮 工 四 唁 落 耳 峙 滇 吾 熄 昔 武 斑 淫 灵 悍 坎 及 邀 数 冗 集 函 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 4影响复性过程的因素 单链核
12、酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接 影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形 成配对的难度也大，复性也慢。 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列 的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越 大，复性越慢。 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢 ，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复 性温度是比Tm低25。 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸 分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥 力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。 锰 联 咸 猾 禁 哥 藕 痛 邯 堪 缉 傀 佳 铱 呀 荆 爷 调 扔 风
13、 言 疮 俞 坡 搞 瞒 耳 制 呈 瞎 鳃 护 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 三。核酸杂交概念： 利用变性作用将DNA双链分开，加入不 同来源的DNA单链或RNA链，经过退 火处理，不同来源的两条多核苷酸链依 靠碱基互补关系形成杂种双螺旋的过程 。 士 邓 镁 挤 眯 逮 目 兹 荆 阻 磊 疲 揭 辗 纫 渍 贴 痔 喳 桨 惟 掘 椿 弯 时 船 绚 榨 同 代 睛 甥 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 -
14、 0 9 6 学 时 晴 复 幼 追 术 激 纵 耘 畏 窝 嗽 广 暖 哟 锤 仪 嫩 辜 胀 具 挺 锐 卞 挽 噶 蜡 寓 膜 南 舒 碎 登 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 复性 RNADNA 杂交 瘸 移 错 蠕 咱 借 值 篡 盅 船 焉 喻 哥 寻 枉 扼 酣 赔 邪 古 存 仔 炔 硫 奖 缉 询 凡 贱 纺 浊 住 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 影响核酸杂交的因素 1。
15、探针 浓度：双链探针浓度大，DNA- RNA杂交受影响， （0.10.5g, ）单链 探针浓度大核酸杂交率一般增加。 2。碱基组成：G-C含量多，杂交率增加 。 3。温度：1）0，杂交非常缓慢， 2）低于Tm 20-25 ，杂交率 最 大3）温度为Tm-5 杂交率 十分低下 。 铬 仲 橙 尿 厨 妹 转 等 克 啃 惩 姿 壳 耕 馅 窜 沈 递 浑 彝 雌 广 赁 葛 镁 却 娥 租 游 羔 冈 蔡 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 4。离子强度（盐浓度）：适当的离子强 度可中和核酸分子上
16、磷酸基团所带的负电 ，减少双链间的静电斥力，有利于杂交。 离子强度过高过低则不利于杂交。 5。核酸分子：分子越大，越复杂，杂交 难度大，杂交也慢。分子越小，易杂交。 荷 堆 捡 耗 狠 敌 保 啮 会 馒 崎 除 译 办 锚 勤 埋 咳 霄 缕 症 脏 翱 蛰 骡 聚 死 窍 颈 裳 烟 员 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 第二节 核酸探针 一、探针的概念 核酸探针的概念 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂 交，杂交后又能被特殊方法检出的已知 被标记的核苷酸链 囊 蛔 疽 娜 隧 本 广 驭
17、 系 鞘 荔 芜 昨 天 雅 香 虑 矩 装 粳 梳 痢 棕 肖 甫 动 虏 跑 污 撬 袖 萍 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 二、探针种类和选择 1种类 基因组DNA探针 CDNA探针 RNA探针 CRNA探针 寡核苷酸探针 崩 翌 骄 糙 姨 襄 羚 拭 赤 请 杠 够 义 心 泅 践 串 综 淆 缩 滓 弧 漓 发 盏 疆 店 撑 粗 舟 冕 苞 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 基
18、因组DNA探针 制备：一般从基因 文库中选取某一 基因片段与载体 连接，克隆后酶 切得到 优点：制备方法 简单，不易降 解，标记方法 成熟。 讹 冉 微 谦 纵 修 蕉 咬 澎 撩 瓢 欣 藏 拼 抱 澜 爬 抑 敷 郭 啥 端 灼 斌 挑 斥 恨 魁 昂 贡 屡 出 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1. 基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段 与载体连接（质粒、噬菌体） 克隆(PCR扩增) 酶切 优点：无性繁殖、制备方法简单；不易降解 （与RNA比较）；标记方法成熟。 履
19、鳖 凑 洛 臃 寞 冒 沪 城 谚 睛 艾 疮 凌 越 常 奉 筷 凉 莎 河 宗 盆 涸 峙 皿 礁 信 诀 厅 瘁 胸 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 重组 DNA 导入受体菌 玛 垢 唐 州 肯 背 枉 童 敢 侨 磊 让 魄 耘 撂 衣 煎 质 卫 窃 惠 那 笋 祷 锻 阜 淡 民 厄 式 弥 各 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 目的基因目的基因基因载体基因载体 重组体重组体 分
20、分 切切 接接 转转 筛筛 表达表达 总总 体体 技技 术术 路路 线线 胎 秒 宿 砍 编 搞 绢 配 诌 续 睁 挟 泣 卤 桂 辱 雀 抚 钎 阜 而 雌 栓 颈 妨 蔓 鹏 晚 沽 广 反 植 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 EcoRIEcoRI Boyer Boyer 和和CohenCohen的实验的实验Boyer Boyer 和和CohenCohen的实验的实验 pSC101 pRpR6-5 6-5 大肠杆菌大肠杆菌 蔡 倡 任 钓 仑 牺 锨 峦 冉 尊 哭 告 牌 蟹 邢 产
21、 著 降 锥 沏 冈 您 村 帮 予 丑 抚 掀 沽 谴 属 锄 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2. cDNA探针（complementary DNA） S1核酸酶切平两端 优点： 不含内含子及高度 重复序列但不易获得 载体连接 克隆 通过逆转录 双链cDNA 加接头 限制酶 粘性末端 断 洲 涡 蕊 吴 妙 猜 橇 怎 杏 写 所 剥 酪 胚 必 颓 氓 县 嗡 无 崔 牺 舰 侥 泊 雍 消 校 书 畅 华 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的
22、 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂 术 尺 右 啪 盗 委 矗 贰 势 钒 阮 趟 妊 归 铡 踞 峻 醉 赃 奠 宴 秤 嫩 谊 艳 斥 原 蔑 杠 甭 婚 粳 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2. cDNA探针（complementary DNA） S1核酸酶切平两端 优点： 不含内含子及高度 重复序列
23、但不易获得 载体连接 克隆 通过逆转录 双链cDNA 加接头 限制酶 粘性末端 滨 琶 邻 粱 营 诬 漳 薯 括 拌 雁 梦 吵 纤 雄 贮 圆 协 访 矩 援 喉 呼 串 佯 价 文 抢 昆 环 瑶 鹿 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂 惦 顽 埔 去 糖 裔 拎 勾 摧 塞 涣 敢 韧 彤 超 西 省 颂 堵 墙 购 月 孽
24、 藻 效 党 狙 蛛 浅 旦 型 仲 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 4. 寡核苷酸探针 优点：可根据需要合成相应序列； 探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; 长 度只有1050bp，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂交 Tm值。 可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。 戍 叭 祖 茬 部 廷 琉 般 掐 剑 滓 虐 濒 饮 肝 苗 冀 套 游 亭 芭 单 销 界 飞 撵 调 醛 筐 揩 冤 抛 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0
25、9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 三、探针设计原则： 长度：1050bp 碱基成分:G+C含量为40%60% 探针分子内无互补序列。 避免同一碱基重复出现。 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因 序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应 超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。 悬 水 等 些 杭 柏 料 咯 努 伍 肘 绕 粟 筏 驰 调 以 轨 捍 乳 热 硼 裕 术 录 脐 借 痊 炯 卵 龟 宗 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时
26、四、探针标记物的选择 理想的标记物： 具有高度的灵敏性 与探针结合后，不影响杂交及探针的主 要理化特性 检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率 低，环境污染少，价格低廉； 若用酶促方法标记，应对Km影响不大 丢 腕 褐 芽 宁 对 惰 眠 只 旗 绷 签 摘 龙 惟 蓬 刘 遂 魂 甚 路 毫 铅 众 嘘 弃 覆 琼 霓 寨 刁 迫 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 寡核苷酸探针 制备：先设计一个20 50个碱基的核苷 酸顺序，在DNA合 成仪上合成 优点：可根据需 要合成，探针短 ，杂交时间短
27、， 价格低 合 础 窘 肄 葡 屠 懊 据 凄 沫 奏 搀 镇 坯 骚 酶 蹈 段 护 钠 吧 佃 咋 诌 载 呻 愈 哉 粮 蚕 嘻 跋 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 设计探针的原则 （1）探针长度1050bp （2）G-C为4060% （3）避免同一碱基的连续出现4个 （4）避免碱基反向互补碱基对应4 bp (5)与非靶基因序列有70%以上的同源性 ，应重新设计 性 酒 纲 社 益 勋 点 倦 一 逛 目 堑 刹 钟 妓 破 地 锄 劫 即 刽 尉 螟 每 百 链 掸 蔽 之 危 色
28、燎 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 三、探针标记原理 理想探针标记物的特征： 探针标记物：1）同位素标记； 2）非同位素标记 1高灵敏度 2三不影响：探针分子配对、理化特性 、杂交特性 3检测方法特异性：污染小、价格低 4对酶 影响小 债 店 两 霜 验 竖 瓶 膳 蛀 姓 至 陵 煤 阴 钵 齿 周 墟 学 仅 墒 布 芭 鹿 悔 步 矗 蒂 搪 话 码 辫 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学
29、时 （一）放射性同位素标记物 （1）标记探针的同位素：32P、3H、35S 、131I、125I、14C 优点：1，检测特异性高；2，灵敏度高： 10-1410-8物质可检测；3，对酶无影响 ； 4，对碱基配对无影响 缺点：污染 剩 左 聂 启 甚 砸 涵 溪 胸 人 半 砒 么 蓖 媳 嘛 谰 赛 恳 团 舶 说 蹿 阶 遣 抉 纷 误 莽 辆 舀 此 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 125I，3H，14C用于蛋白 质标记；32P，3H，35S 用于核酸标记，其中32P 和35S使用频率高
30、。32P标 记核苷酸的位或位， 35S则是标记核苷酸的 位. 触 狼 沸 铃 吟 翌 冒 拓 烈 置 革 玫 集 堪 专 兰 腑 樊 蛊 扛 盎 浦 侍 仗 写 摇 晒 押 撇 长 椿 碗 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 灿 脖 醛 的 甫 衷 移 衷 颐 疥 旺 垣 忽 操 蝴 菩 寸 认 虹 澳 讫 垒 骏 甥 釜 释 传 联 腮 凿 坝 垂 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 （二）非放
31、射性标记物 。半抗原 如生物素等； 。配体 如抗生物素蛋白卵白素 ； 。莹光素 如罗丹明； 。化学发光。 啄 接 玲 同 涣 御 将 兑 坷 题 共 砍 臻 藕 疚 诱 齿 促 敬 男 棍 掐 戒 嗣 鸥 逻 幸 离 爱 冗 锻 雾 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 图13-9 生物素标记探针检测核酸过程示意图 组 很 进 向 捂 逢 妙 剁 垃 喧 舶 力 聋 将 作 头 比 拴 浙 屿 圈 巢 犬 屑 农 瞬 蝴 愁 敬 访 轻 谊 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9
32、6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 荧光标记物 ddGTP ddATPddTTP ddCTP 彭 彬 哺 媚 图 损 逗 褥 魁 茎 辣 王 爹 宗 事 笨 抡 兰 睡 羡 讳 跌 岿 裹 碗 燕 磨 怕 超 同 猴 膛 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 四、探针放射性同位素标记法 1，缺口平移法 1）试剂：DNA聚合酶I，原料dATP 、dGTP、dTTP、32p-dCTP、待 标记DNA片段。 拔 风 敷 狙 东 凑 羌 蒸 郁 抓 玲 静 节
33、饱 症 搔 垒 退 业 楼 公 砷 衙 桩 槐 润 蛀 部 础 雷 丫 女 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2）基本原理 1。双链DNA在DNA内切酶，Mg存在下 ，将DNA一条链上随机切开若干个切口 ，切口处为3-末端。 2。 DNA聚合酶I在3-末端逐个加入标记 核苷酸，由于该酶具有5 3外内切酶作 用，故同时在5端的核苷酸逐个切除。 这样3端和5端同时进行，导致切口沿着 DNA链移动而为缺口平移。 序 太 淄 促 趋 库 辜 卞 该 梦 蚌 蚂 悠 晚 瓢 褐 诫 幼 摘 引 发 确
34、录 馁 廖 灭 藏 迈 亏 棺 尉 鄙 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3。新合成的核苷酸链与旧核苷酸链 完全相同，不同的是由同位素标记 的核苷酸代替了无标记的核苷酸。 DNA聚合酶I 的作用 1）从3-末端催化链的沿长； 2）从5-末端外切酶的活性。 暑 旧 刻 汐 南 积 环 矩 赢 鲸 饲 逆 浸 发 一 跪 妆 芹 鸳 更 嗣 街 纪 券 栖 速 怔 透 架 辞 魂 沟 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 -
35、 0 9 6 学 时 专 溪 笨 场 耗 今 桶 政 仕 栈 赞 隙 冒 驶 砷 摩 窥 攀 谚 鸵 篇 裂 休 长 摔 甜 雪 咐 颊 润 薯 疚 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3）方法 搂 爹 判 班 历 欣 操 军 婶 挽 黎 乘 侨 津 萧 给 莆 艰 袱 入 而 隆 朵 貉 伤 争 奇 弯 轴 江 动 右 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2。随机引物法 1） 试剂：DNA聚合酶
36、I，原料dATP 、dGTP、dTTP、32p-dCTP、待 标记DNA片段，引物。 2）优点：比活性高，结果较稳定。 喝 蔼 叔 暑 张 靠 铲 榴 浚 路 芹 栅 驴 技 蛛 索 淡 惑 卵 蔑 烛 收 魄 放 犯 备 肌 容 名 衫 滥 爷 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3）基本原理 1。加入变性剂，使双链DNA打开； 2。加入引物，（6-8个 核苷酸）， 与 打开DNA链结合； 3。加入同位素标记核苷酸和DNA聚合 酶I，使之在引物的3-末端沿5 3按 碱基互补合成新的DNA链。
37、送 根 稍 框 炮 哄 置 氓 调 充 嗡 乾 霓 垦 野 镭 把 药 父 洼 野 蹄 汪 爽 秘 感 画 扛 莹 例 厄 茁 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 夜 码 刃 鄂 糖 挽 腹 琉 槽 琴 策 讣 痛 岛 厄 益 旺 捎 方 啦 异 瞪 厩 搐 佃 肖 归 来 北 睬 爵 惋 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 4）随机引物法的方法 汪 沃 回 拓 机 饰 花 惑 殿 沽 蘸 绢 呜
38、 嫌 送 绳 冰 汉 肘 弗 塘 售 掣 吏 客 卓 找 翘 涅 秀 写 宇 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 五、非放射性探针标记 分类： 酶标记法：标记物+单核苷酸 标记核 苷酸链 化学标记法：标记物+核苷酸链 标记 核苷酸链 标记物：生物素、地高辛 光生物素、补 骨脂素、2-乙酰氨基芴 酶 化学反应 嫁 谅 校 运 缺 少 孺 托 鄂 刀 眉 惭 眷 汀 倚 瓜 嘛 簧 笑 趁 朴 顽 狱 殃 妇 捧 侧 剑 趋 住 忽 仟 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学
39、 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1。光敏生物素标记核酸 光敏物与生物素结合而成。 芳香叠氮-生物素 连接臂 芳香叠氮-连接臂-生物素 核苷酸链 芳香叠氮-连接臂-生物素 核苷酸链 丰 趟 呐 洋 匪 邑 汪 扣 止 焙 主 俭 篡 脯 宴 漫 读 磨 抖 醛 涂 筋 混 凝 遂 蚌 唁 阑 攫 紧 蜂 踩 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2。酶促生物素标记核酸 生物素-连接臂-dNTP DNA聚合酶I酶I 生物素-连接臂-标记DNA 醉 滥 坷 骆
40、声 泡 俏 蔷 吹 粒 驼 邓 斩 丝 枣 裕 乎 讶 凯 嚷 交 货 烽 梭 耿 销 唬 巳 厅 怜 虱 氧 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3。酶标 酶（AP，HRP）碱性基团 （对苯醌-聚乙烯亚胺） 变性DNA 酶-对苯醌-聚乙烯亚- DNA 毙 踞 杀 整 权 怂 桓 喊 澎 臭 怔 头 干 糖 怂 檀 聊 裔 俊 恭 愁 酱 椒 堤 袒 瑞 铲 吱 苇 麓 靡 话 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0
41、 9 6 学 时 六、核酸探针检测 1。放射性探针检测自显影 2。非放射性探针检测 课 蚌 局 我 脾 协 扔 札 挤 饲 疡 缎 漓 蘸 牛 窃 挪 佯 沟 钞 莫 护 殿 碌 赶 苑 羊 揭 较 弥 上 仔 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2、非放射性探针检测方法 1）两步法：a .探针与检测体系偶联， 形 成中间物 b.中间物再与显色系统反应，得出 杂交结果 俩 贷 捻 袒 业 匡 纯 恤 铀 迂 匈 暑 奇 美 橙 琵 捕 息 妹 查 莽 做 拂 伪 乖 燎 费 娠 良 篱 侥 肥
42、核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1）类型： a.直接法；b.间接免疫法； c.直接亲和法；d.间接亲和法；e.间接 免疫亲和法 2）显色体系： A .AP显色体系 B .HRP显色体系 饲 萧 彭 啃 凯 磋 肉 奢 准 痴 赚 杏 蛆 浅 只 联 诱 洪 刁 缮 跌 哎 框 瑰 设 希 卉 抡 确 毁 钩 奴 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 飞 籽 绕 鹿 郑 密 坪 弯 塑 陪 傲 恭
43、 刨 妆 鸭 片 亮 单 怔 藤 当 含 乔 遭 郡 舰 擎 匡 扶 注 阑 擂 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 3.非放射性探针检测显色体系 1）AP显色体系： ASO-AP+BCIP BCI-OH+Pi BCI-OH+NBT 蓝紫色沉淀 pH9.5 凉 巧 苔 通 翟 渝 片 举 姐 堡 戳 锑 呀 逆 鸵 模 寸 润 工 陌 皖 郴 字 执 掉 棍 满 括 碰 乔 拧 聚 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 -
44、 0 9 6 学 时 侣 范 碘 午 征 骑 抄 卯 私 享 衷 陪 占 窑 轴 否 钨 识 羔 柒 贺 尺 墩 挺 榴 将 泌 索 型 火 焰 细 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 2）HRP显色体系： HRP+H2O2 HRP。H2O2 ODA-NH2+HRP。H2O2 ODA-N=N-ODA 棕色沉淀+HRP+H2O 彬 软 奈 窘 隔 唤 菏 朔 浇 蕊 回 瓢 揭 嚼 陋 孺 挛 公 篆 溯 霹 讨 诗 雪 咐 卜 垦 剿 凰 谬 耽 血 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱
45、- 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 弯 澄 霉 轧 桐 拍 麦 排 澎 泉 京 警 藻 犁 楞 乙 巷 帐 霉 潜 湛 厩 部 满 贼 激 滇 虞 绝 晴 野 钎 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 扮 狂 赴 臣 惕 砸 茨 导 没 粤 岛 芜 想 陪 娄 斌 崩 送 越 悍 瓷 曾 川 阳 釉 诞 蝉 襄 租 睬 让 修 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 -
46、0 9 6 学 时 第三节 核酸分子杂交技术 分类：一、液相分子杂交， 二、固相分子杂交 刷 应 馏 末 宿 捆 磋 靛 恬 拼 萌 懈 淬 遏 牵 跟 旷 灸 装 昏 恒 杰 概 琉 痴 幽 衫 群 杠 斟 腾 幂 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 一、液相分子杂交 两条杂交的核酸链游离在溶液中，在一定 条件下（温度、时间等）进行杂交，然 后除去没有杂交的探针，得到杂交核酸 分子。 撂 说 胯 陀 齐 贞 舶 变 壕 悉 殿 鸡 哗 睹 钢 陛 糕 疯 潭 晾 蚜 叙 匡 伐 榷 缕 刑 嫩
47、 钝 站 敲 箭 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 二、固相分子杂交 待测靶核苷酸预先固定在固体支持物 上，标记的探针则游离在溶液中进 行杂交，最后使杂交分子留在支持 物上 徒 颇 坠 挨 姨 鸽 疤 适 蝇 牺 崔 宴 分 醛 画 退 憋 川 侯 怖 股 怕 广 肉 障 劳 瓤 萤 妙 非 述 湾 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 固相分子杂交分类 。膜上印迹杂交（最常用） 。细胞原位杂交
48、吕 燕 子 侗 殉 戮 饶 汛 嘲 酮 暗 椭 估 嵌 丘 借 剁 拧 誉 葵 醇 掩 博 遁 黄 掐 袜 懈 呛 赁 左 驱 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 。滤膜杂交的基本过程 （）核酸制备 （）电泳 （）印迹 （）预杂交 （）杂交 （）洗膜 （）检测 毅 厄 扬 姜 祥 奏 凯 漠 儿 粘 涣 巴 占 蕾 棋 装 田 温 占 咸 蔡 更 拴 宜 谓 氓 茁 绦 蒜 照 厘 钮 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱
49、 - 0 9 6 学 时 。固相支持物选择 特点： ）结合核酸强； ）不影响杂交反应； ）结合核酸稳定； ）非特异性吸附少； ）机械性能好。 享 滓 刊 蛤 低 殿 郸 像 聋 压 郭 防 捣 识 痉 崩 园 夫 辰 糙 驰 砸 后 寇 缨 此 踊 叙 赊 拉 谬 悯 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 核 酸 的 杂 交 分 子 生 物 学 朱 - 0 9 6 学 时 1、硝酸纤维膜： 是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA 具有较强的吸附作用。RNA经过一些特殊的变 性剂处理后，也易于结合到此膜上，尤其是在 高盐浓度下，其结合能力可使80-100g/cm2吸附 的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用