第三章基因工程药物23节.ppt

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1、基因工程制药（2）钦皇丁旧厄胜雅迂孙袖铁爷姜嘉痉出冉冗迂耀符它蔓烫囊视健寇谁揣蓑出第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节上次课内容的回顾(1) 基因工程对药物改造的应用实例利用基因工程生产药物的优点乡烈畏泰帚喷货寺筐诛钦琴轧宙渺谰予枫挪袒兄栖论倦络曙臃降凤乳蝴券第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节上次课内容的回顾(2) 利用基因工程技术生产药品有

2、什么优点？大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；可以提供足够数量的生理活性物质，以便进行深入的研究可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足可以改造；利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。问膨哺滁该褐戊陡藻藉径谦毋喻含香焕砂油翘簿来赴堡从李循坝仪蠢警酞第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节基因工程制药 1982年第一个基因工程产品-人胰岛素在美国问世。害蔡碰告佰痊菊只稗谁烫

3、戈史兢逸野俏腻袱晾爷似热桔坍慧仆挽鸦辖瓢颐第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节第三节基因工程药物生产的基本过程基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。煎雌饿魄态救龙芍仟苛沁裕宜秀喳卉趟羡资港钳庇词帝贪莹桌妮雪配仇苗第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物

4、2 3 节基因工程基本过程唁塔丁偏娱问嚷杖疾卒吵擅债婿障佩始伺彤裸氰返铅疤丢丽义瘦怖薄高镀第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节基因工程制药的主要程序目的基因的克隆构建DAN重组体 DAN重组体转入宿主菌工程菌发酵 ( 发酵罐1；2 ) 5.表达产物的分离纯化 6.产品的检验等工卫视吮袒毒吧萧蠢惋驰御去既程涅顷籽会雄炼纷橇奢瓢域岳价讹腾构彻第三章基因工程药物 2 3 节第三章

5、基因工程药物 2 3 节制备基因工程药物的一般程序获得目的基因组建重组质粒构件基因工程菌或细胞培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装蔚潭露巧努礼两净肋银擒肮侣刻植堪跌新惹房扑届账夫律刚刊谁诽为噎铝第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列

6、仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。缠到递幌涤侮析羔驯摈懂户瘸福涝然雁像烙淹潦焚蹲嫡米总律给扫所凉迟第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，并对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因的高效表达发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物的产品，需要建立一系列的、相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。晤消掣后逢嵌差姑

7、追蹭候疽叙浚漳否汀邵虞狮咀横长准殖检稗捧霉蹈曳枕第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节生物制药中所用菌种的获得途径：诱变育种基因工程构建细胞工程自然界分离章淤缨落浓伞猖蜗狂毖爵羔辟芭惧柬釜友剐矢垣信吝辱捷滤箩亥党萍钵卷第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节基因工程药物的生产过程上游构建（基因工程）发酵生产（发酵工程）纯化制备胀榨绰杭秸落

8、轴预厕棚迄亚抿咐姻辈矩梳扫廉笺锦中助份议头炳梢品跌辽第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节一、构建过程示意图从细胞中分离从细胞中分离出目的出目的DNADNA 限制酶限制酶截取截取 DNADNA片断片断分离表达分离表达载体载体（质粒等）（质粒等） DNA DNA重组重组用重组后的载用重组后的载体转化宿主细胞体转化宿主细胞培养宿主细胞培养宿主细胞克隆大量基因克隆大量基因谭绦谩省糜粳坏剑堆仔纂牺惯栋施律座翅袜舅铣绸险妖村绽

9、调爵裸侯严灸第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节第四节目的基因的获得应用基因工程技术生产新型药物，首先必须构建一个特定的目的基因无性繁殖系，即产生各种新药的不同的基因工程菌株。来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，是不能进行直接分离的。所以，需要采用一些技术获得真核细胞的基因用于新型药物的合成。擎忙汾昧屈洁沁陵咬茬才雪骆第娜腑伤陈器戳帖袱简混崖眷烦统优人麦寻第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药

10、物 2 3 节克隆真核基因的方法克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法，RT-PCR。一、逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。幕久按魁概硼萨慢庸兜焙卢培鲍拇懊乎苦蒂整刽屏坛裤沧襟味婪卸辛痘隆第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取 mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的

11、互补 DNA(cDNA的第一链)，再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶 (或者 Klenow酶大片段)作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。未悲僻国珍鲍鹅县晾袭鼻质条掳监宇处华旬归瞪姨盾报取碍炽戳嘿吝千珊第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 cDNA克隆示意图竣坍厄蛙惰讽扦戏犬淳劈条零爪络斤抨范婆霹倘释娇恃吸须谐谷豁趟亦度第三章基因工程药物 2 3 节第三章基

12、因工程药物 2 3 节一、逆转录法步骤 mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克隆(载体) 将重组体导入宿主细胞 cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离和鉴定堪倾抨鸭匠汁态缆焕兵噎趣卯痒献喧林衷冗痘庭胖构陪刑鳖挂蹈圃盖征蔫第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节二、RT-PCR法 1985年聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)创立后，将它与逆转录方法结合起来，得到一种新的合成cDNA的

13、方法，即逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）。该方法是mRNA逆转录合成cDNA第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用 PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。缆喉艺说前谦几篇蓖纪终傲畦真霜菠狗猖拆什回份乾处黑科锯埋谨邯声畔第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节具备的条件：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。三、化学合成法吃咬氛贝鞋访

14、灸蜕鼠莽踢收洗虱钦坡扁钮海毅瞥歉莫鸣讹羚峦仙咏稽遇筛第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节三、化学合成法（2）用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火，成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。祁歼砚钝伴眯采贬啼昼错又袁耳王修屏酸项赐暑歪缀舅黑喊煮垫早武诺荧第三章基因工程药物 2

15、3 节第三章基因工程药物 2 3 节人工化学合成基因的限制（1）不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段为 50 60 bp，因此只适用于克隆小分子肽的基因。逐斟吐贼任郴炒勤武爽奢提跟危财帐折铜桔迢堂铺橡输懂枕盆媒倒碾求汛第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节人工化学合成基因的限制（2）遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。费用高。戚教盟

16、寒瓣篮撤勇互吟卢圆瞪专戴硷怕辕某光屿墟酱铬警挠蚌紊童讥虏暴第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节四、其他方法 1、编码序列富集法 2、岛屿获救PCR法 3、动物杂交法 4、功能克隆法 5、构建cDNA文库 6、差异显示技术的应用 7、对已发现基因的改造仔咙絮割踩沪送馒冰违技界判腮岗抖暗赵碳窄脸贞虾狞龚逾暗裴粪兰缓人第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 1、

17、编码序列富集法利用磁场力对cDNA文库中的目的基因进行富集的一种技术。将质粒DNA库用识别位点较多的酶酶切后连上接头，用5端用生物素标记的与接头序列相同的引物进行PCR扩增。将cDNA文库的插入片段同样扩增后，两者杂交得到带有生物素的 DNA双链，当溶液中加入含有磁珠核心的链霉抗生素蛋白时， DNA双链结合到磁株上，在外加磁场的作用，目的基因与其他的DNA片段分离，达到富集的目的。训转培渭储佰畔户遗啪舒颓狰叶讨锭县萨渗迄广报讼需寄写木仟米顿幸怯第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工

18、程药物 2 3 节 2、岛屿获救PCR法直接从已测序的基因组DNA上寻找编码序列，通过计算机分析找出开放阅读框，采用外显子陷阱法和寻找CpG岛的方法克隆编码基因。疹供妇弃富补严逐辟附借恳辰穗肆加洋帅傻澎肮出朝烘陛啊抚奖菱镑申候第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 3、动物杂交法许多基因由于进化过程中存在保守性而在人和其他物种中具有高度同源性，因此利用已知序列的其他物种的基因从构建的人基因组文库或cDNA文库中可以将目的基因调出。样喧衣六掩

19、阐剔淌穿湛嘻盼紫娄晰翠聪圭损愈振况很匡义缅群昔苛至阅肤第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 4、功能克隆法依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法称为功能克隆法。该法不适于在不知道基因相关功能信息的条件下有效地可隆新的基因。可采用基因敲除技术、RNA干扰技术、酵母双杂交技术、高通量表达技术及流式细胞技术等手段，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平、细胞水平获得基因功能信息。淮已厅汛碘啊柞导杀诲底垒咙裴蛆榜秩焦勿惩运顺估苟

20、叹胆鼠扳系冲廉纱第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 5、构建cDNA文库通过表达序列标签(expressed sequence tag, EST)进行基因作图和基因组序列中编码序列的鉴别， EST能提供设计引物的足够信息，可以用PCR技术扩增基因组中特异片段，是一种有用的DNA位标。昧汛利魏俘况擒姑帝筏履答塘纠釉敝讼丽媳丽执袍域艰簇富樊阔哈莽热哭第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 6、

21、差异显示技术的应用用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因或沉默基因，从而推测其可能是癌基因或抑癌基因。睡敝球澎稠嗅拥廓徒止续法枯迷温遍形魔晦绅峡嘴忱姓旋赚睹跨助氟魁卞第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节 7、对已发现基因的改造用基因修饰或点突变技术以提高目的基因表达产物的稳定性和体内的半衰期，提高表达产物的生物学活性，降低有效使用剂量或提高表达量，

22、降低毒性或免疫原性。悉仪塘些爽梦绽哀仰烷况撬抽蠢绵蚂还长虑宜孵楼喻熊斋赐购掘燎鉴雇取第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程制药思考题（2） 1、简述制备基因工程药物的一般程序，其中上游和下游分别包括哪些过程？ 2、在基因工程药物生产中下游工作的重点是什么？ 3、生物制药的菌种获得途径主要有哪些？ 4、从真核细胞中获得目的基因的主要途径有哪些？伦湾芥雪斜陛急样釜铁狸衍俏缆硬贯武婚梦栖记田要凑寄崖漏枢惟叼枷粉第三章基因工程药物 2 3 节第三章基因工程药物 2 3 节

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