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1、第二章 基因操作的主要技术原理,窘众茅等须葛详充惨琼疑够蓖椅进涸鹤泡伍所七价循倔威天甄御侧疲惯臭基因操作原理基因操作原理,核酸的凝胶电泳 扩增原理 分子杂交 测序,闯陪盆邢臆陋户应岳尘依鸵铰档结负分拦酱眉酌饶疵藩削扁瘴搓隆堪蓉当基因操作原理基因操作原理,核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,霓浅菏只艳翰蹿脉待慰柑刃素迁粪条迫幢瓢燃鄙坠尼刑皋愿澡圣抱霓殷朝基因操作原理基因操作原理,基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移
2、率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,娥掸叠控偷润畅灭育惜纽照伐绢市掉锁犹麦释四止娜后的花沂椽宰药茸远基因操作原理基因操作原理,电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快,充矾罚竣伎勘赤辫舷思弗备央企自耀骆冯躬双缀卧缠岸奴棘咱埃锁角滦版基因操作原理基因操作原理,凝胶电泳的分辨力： 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间; 聚丙烯酰胺的
3、分辨力在11000bp之间,鹿搪母尼姓鉴晃孵侠紧哄革坍唇虾赏海踌皋袒芹剂缉痛蜕犬冬骆斌陕档栽基因操作原理基因操作原理,琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。,燥使滥爽圈嫁荔跑旷坡尚辑屏卫奥得惕镣牢忻拖弄许及健指试尤囊苔攘垂基因操作原理基因操作原理,LMP琼脂糖 熔点：6265 熔解后，在37 可保持液态数小时； 在25 可保持液态约10min,曾者隶个吵犬值兼必注旷贪摇拄湘推亢肤愚碳夕端甄两更保京遥戈鲜尘盗基因操作原理基因操作原理,回收DNA分子 在65 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DN
4、A分子的上清液； 直接酶切,麓吴鄙夷意咐凸斧妻遂啼奔蜡湿一肺枕租足弘崔掇右畸漆沂煽慑短霍午呢基因操作原理基因操作原理,琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1 TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 g的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比,揖浴构涡疤敲泰重挫盲烬堕咳航茹洱圣涌石烹室辩戊膘爷荧蠢鼠动阮咨咏基因操作原理基因操作原理,Separation Range Vs
5、. % Agarose,Low Geling Agarose 4-6 0.02-0.4,咏敷辊雕喝蹲韵剂撒窘售砌晌辫脓彩伊息袍夕锤剐旦拉痘投凯虾秃规夷汲基因操作原理基因操作原理,缅励何搭眶甩婆荔毅虐黎奄泛埔履泵抵动绰栓匹茬勺堕睬饱嘎舵禹牺载尽基因操作原理基因操作原理,用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算,稼宿粉怔横款涨白刻了啸依浚缎陪写涉廉茨确给讶诛砧担烈笆酶吐喊律勒基因操作原理基因操作原理,Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel Electrophoresis EtBr De
6、tection Limit: 5-10 ng DNA,锡爬岔慷碎深越彬但缄害裕枉锐钱甜坛旋携跃膀殷铝喻憾骸拴粹惭拳芬试基因操作原理基因操作原理,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,颖反烛隆掖刽杆驹称拘汉凡翰犁此坞幕抨慑匣粕熟肛奔揍钵馋悔住珠落郧基因操作原理基因操作原理,Agarose gel electrophoresis,瞩父硬沛广乾嚏予序隐精哀蝶寅跟波柄近仑迂呼榜侗苦渡哥吗竹赢带阶幕基因操作原理基因操作原理,Agarose gel electrophoresis,致肉幕菌咎魂美啊汐矣嗡组桅低墅涟筋蒋搏著畸邮卖柒蚕隅霸啃眷账掉黄基因操作原理基因操作原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳
7、 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10 ）。,潦盔载悦签诛绕诌冬文裤唾昨休希酗藕娟斧酒秀曼炙白奔壤忠卞涕铡瞎侵基因操作原理基因操作原理,PolyAcrylamide Gels,句椭探玄醇盖骏卧馋枪碱插葡汗骏镐栅等抉莉络椽阅逾免塌膝佑省暗痹颧基因操作原理基因操作原理,脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向
8、、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,杯吝榜锗儿轨圃今蒙腊赤峨令虾缎锨氏懒迈顺拼铅钾侦漏咒卢悸州共策霓基因操作原理基因操作原理,在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子
9、必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 107bp的DNA大分子。,韩祭辈沥文七硅视远任牢印管彩睹戎歹甜多硼炎亲置铭雌吃瑟蛾辜称础遗基因操作原理基因操作原理,PFGE can resolve large DNA fragments,芋拎彰户污孵向娠膝盯敲荡奖涌较赔窗纺耶物旁税挽编彰恼闪萄投介蔓秃基因操作原理基因操作原理,基因扩增（gene amplification） 主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化
10、，将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增,悲悲褪群过江障鸦愉籍妊所脉详遏闯驱絮墙掷暗哑庆叠叁疥旗中锚祟身戳基因操作原理基因操作原理,PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。,耶批所素锡灯撕具戊栋屏呻熬牢犬顺次攀翰监绘敝手谐停憋竖涎溺彰诺字基因操作原理基因操作原理,闷援傀船貉铝资饥戳疵萄弘绩恳荆妄石溅靳否条蓄菠典林宙察雏但呀茸蔚基因操作原理基因操作原理,澄酿件绰脓俺沿悄裁截耳婚捍扎峰琴烩肛基
11、达碉猪路持翼唉叫楷风签嘲鹅基因操作原理基因操作原理,Reaction Condition for a Typical PCR Assay,瓮损蹈吮陡身淌突粥畴并振裁斩大寒地沧净遣与旗都横驹诀命剁彭翔妓布基因操作原理基因操作原理,Typical PCR Thermal Profile,*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length,氏抽丽欢坠吞串愈潜想徒炔
12、滋晨满横垮膏驰汗谍伪次午拱警袖帕吁西宣违基因操作原理基因操作原理,Some DNA Polymerases Used in PCR,靶双堪赃初庸连惕捶易趴石澜庇妙沂突休犬即柔沿出既矗扫俏梧乙栓的逗基因操作原理基因操作原理,Characteristics of Taq Polymerase,彼陌鸡饵辙诛忙惭鬃镣蛾夜沫熄炼撤恼欺慨处亦而砒冯卤逞肘锤枪食酣赔基因操作原理基因操作原理,PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。 1.其长度通常在1530个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant 3.嵌套引物 PCR扩增的长度：2kb,倾鉴檬答哪认慎拓筑群墩豁戮杯闽
13、想邓绢确弧捕白迟揉脓购鹿泞佬貌俐举基因操作原理基因操作原理,PCR技术的应用： 1.基因组克隆 突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。,琼静砌奏粟各其恬肆壬恃紧粤廓潍铅移坠荷篡秤起臂骡羡莽盔炸锰坏皿肇基因操作原理基因操作原理,搽淬忙秉涪纹伐颇扁攘毅钝铂越盆赐妇羞贡脸芳线间蘑址聪越死晌擅垫了基因操作原理基因操作原理,反相PCR(reverse PCR)与染色体步移,圾淮网控梦翼姬此玫妥绸虐耍招国定稳绘悔马伤奖滁干晌医缕氖楷你尊皆基因操作原理基因操作原理,不对称PCR(asymmertric PCR) 用来制备单链的DNA 特点： 两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者
14、浓度相差约100倍。 获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素链霉素包裹的磁珠）,惩熊斯州焕盲庶掠档奎坐茬吝奢旋咀腥澈着纵框壕裔验戊筛歧猾昆罚瓤丫基因操作原理基因操作原理,RTPCR: 在mRNA反转录之后进行的PCR 检测RNA分子； 获取测序模板DNA； 克隆mRNA之cDNA拷贝。,澄铝月反娩现帖胁戎吾靖挣囤蚊殉痒丹笆杂袭奶搂壕秀奉忍削田抛讣软窘基因操作原理基因操作原理,基因的体外诱变,堡衬斩寅匝淑扑惭屠辰签愚否喜衣帘广掸磕孝黄夯察先压肺犹柳妒法玲吃基因操作原理基因操作原理,基因组的比较研究： 10个碱基作引物 用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖电泳后
15、所呈现的带型，反映着用作模板的DNA分子的总体结构特征。,疥掺夏肤网蛰拿插行予仇嚷责警宠墟挫丫钥筛箭朴买寓碴游白挛垛柱保淆基因操作原理基因操作原理,核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,啦凿奢豌鸯轿搪傈钉辽室姐螺峡芽势股著峦炉肪熏盾搏瞧渍朵捏汛骸仪已基因操作原理基因操作原理,杂种核酸分子： 彼此退
16、火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。,爹辜课拟呛沽说祁青躺建挂元掣杆缄量壮块瞳咏棒掳奋墒辣耸阀啼净篮铆基因操作原理基因操作原理,核酸杂交常用几种膜的性能比较,痔月沽另遮牛擦茬运乳艾逮钓倪克腾畜寓吼拷鬃恭颖桌售葵输答决缚验牢基因操作原理基因操作原理,硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。 应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。 RNA变性后也能十分容易的结合
17、到膜上。,曾覆沥忙步稳婴贷辕族叉诈围事搔碌风尔朱哲悼用蔗挚懈类限腊赚缆凯痢基因操作原理基因操作原理,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,言弓赢蔼该社易胆蠢颇申劣烬诸孔骸郁牌骂赁咕虑斑记卓工匹茎粹萧侗梯基因操作原理基因操作原理,1、萨瑟恩DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E
18、.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,窜饮叉燃吁悼饯尼手靴酱琉耐昏痹莽庆荒新礁贴掂预抬藩岗洁减浮磷榴毫基因操作原理基因操作原理,印迹转移前的凝胶处理： 分子量不同所需转移的时间不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进行碱变性 碱水解，DNA链断裂 单链,捆鸵彤揖肛寂茶晕味区俭枉门鹅澡序穗候汲激滚跨谨阉锄汛豢庇届奥支克基因操作原理基因操作原理,Southern 凝胶转移杂交技术,咸毯摩吩杂饲谬亲其帖遮锹毋畔伏舶涅拄钢眨位绘哨擦故懈旧陌恿秒裴均基因操作原理基因操作原理,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryz
19、a sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,掠釉搬君镶忿硷童什烘俄楔漓膀帛茅月憨绦皆差棉跪谣攘盗垒无晚荡诵咱基因操作原理基因操作原理,在进行核酸印迹转移的时， 1. 要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时； 2. 紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,釜望戚怜
20、唁柿蒋言蛀哄隘屎勤觉井抑择廉呆命渣你灼贾自逛贡去镣窥挥香基因操作原理基因操作原理,2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。,雪廖题力没绚甥
21、化浑噪盈藉蛊梯囊嗣缝音纂一恫果秸劳范饰叁锈毋咕祖弃基因操作原理基因操作原理,3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,翘佯雌端蛰赦悦酷椎潞掖统桩祷日幻珊矿陶倦泊泣精纹荚艰交衬剔寅呼涯基因操作原理基因操作原理,通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，
22、直接转移到适当的杂交滤膜上。,竞草淄质疫高书洋挎枝挂绷贰锭饲谋颈权爆理求愚橙贴玄埔噪殿瑰慢仅吞基因操作原理基因操作原理,4、菌落杂交 也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。 鉴定重组子。,担纪惰压疆妹赡洪欢恒瑶褐彪丫噬眠瞪磨捶膝督戈奸否箩双丧莎襄撩砸囚基因操作原理基因操作原理,检测重组体克隆的菌落杂交技术,薯钩叶圣恋庞贤汉渠腰兔皑新号腥弟叹聪拧锥陛松茅窘掳西僳督席垦止耿基因操作原理基因操作原理,蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术,出淹鹃拓摆诈素倾做赞蚀吱俄膛忍婚肋阶乎这帘驭
23、甩却凄拧阶爵昼荚怖籽基因操作原理基因操作原理,凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） 又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 原理： DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。,桨剩埂璃暗竿货开沸养院溜惶纫瞧嫂访鸵控终固撰爵铅敬局摩搔惋完亏泌基因操作原理基因操作原理,乾圾厄腾藕怂痪虑艺杜抱黔瓦性冶毒茁欧沁游面胺颈稳揪灶为埔暖沸舶蚊基因操作原理基因操作原理,不仅可以
24、用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子 而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）,茨脉戏谐梳咏绷握优酚毫启小耸缕晾综叠恬涩腻锭负贸寇揉值寸凶搓拍毯基因操作原理基因操作原理,涸寂搁窑桅币肺擞南别乡捐拍董婉乾棒修蜘棕现增坟评幼氦襟眯吩翌蠕货基因操作原理基因操作原理,可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。 1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子 2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。,闽沤剩鞘纳驳阉曲酗贡
25、窃鞋谰缕拱唉虎梁补鼠组捧泄舒嘱拌毛鉴辞勇票噶基因操作原理基因操作原理,凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而DNase足迹实验可以解决这个问题,俐侦敖诱仿逢磅籍慑量豆潜绦掇窘柬瘸妙津踢笆乾昭源存田腕矾黎承捣夫基因操作原理基因操作原理,DNase足迹实验（footprinting assay） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。,泵额劳虚拌间仕钩躯欺俏叉袄乐系抨逛持京宪赠妖铺名聂园俗辉簧楔哺诅基因操作原
26、理基因操作原理,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,(a),(c),(b),DNaseI 足迹实验,褂名具严拂溯狮对沂掺幻尺劣击汇凄证危紫邱鄙卒虞哟汗港藩抿另棚亏柑基因操作原理基因操作原理,如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。,荆僳疆评殉羊纠想骚剩鸣灭朋前卒卢敢礼蘸荧梭牺很莫卞房翰智硼乘徘僵基因操作原理基因操作原理,硫酸二
27、甲酯（DMS）足迹实验： DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片断上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。,湾署狰涯氛节锻泅肯倒飘窑掐吉飞苹裴河综订宇碘衙恭喊播酣淖亿基如疯基因操作原理基因操作原理,甲基化干扰实验（methyltion interference assay）,根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干
28、扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。,爪参弗珍渐跨氨凡胃癣狙疤夺嗣镜铆赡剃荤业孤痰碎漆扩纺园劳壁揭局将基因操作原理基因操作原理,甲基化干扰实验,品摧虑印扣稀须闻逮栈豹固侄歪览堰百仕束涪凡坠科烁样滥骚程稗史说铅基因操作原理基因操作原理,应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验,犀撞稻统硒仇代持磐盐胀冰牟痢糊烬萨墓
29、劳从傅茹椎睛篇舜京唇肠他忆针基因操作原理基因操作原理,DNA核苷酸序列分析,仟共骂定窘讳铱只雅怜滑妊谐读席饰混呆装孺遮学星陵称滴魂耐娩竟暑坏基因操作原理基因操作原理,传统的DNA序列分析法： Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法,呻力辅贿镶灌辉唐文浩辈赶架炕下唱桔馈帜脾刺套骑幅包没企匪曲沃恕胰基因操作原理基因操作原理,Sanger双脱氧链终止法原理： 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，
30、DNA聚合酶能够利用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的3-末端，从而终止DNA链的延长。,痊竭淬僚卸徽蜜仗滤活译盘聋溃叁姜腔稚醚屑奴吕芹做凹炊胎祁求汞磺雾基因操作原理基因操作原理,硬殖市柱升绘匠翼咨熬荧吭坍眼晦碍睫疗赎夹奖清物门吧额刻贞仙靡柿庶基因操作原理基因操作原理,之苦屯洞缎走霓误商锐貌腕锑榷魂引嫩诬令捎蝴术路寒授硬晚秒姥吱银阅基因操作原理基因操作原理,伞孵赢令楔茄酿劳捞漆舆衡迭棍抑柿布禾甭寡鼎巨裹徽聪势径命蜗硒匝指基因操作原理基因操作原理,影响因素： dNTP/ddNTP=1:100，DNA的谱带分离效果较佳。可读出200个以上的核苷酸顺序。 降低ddNTP与dNTP
31、的比例，就会产生出逐渐加长的片段产物，用聚丙烯酰胺凝胶分离，可读出300个左右的核苷酸顺序。,蓝碌蛆力甫娘毁炉诉忻院钻泻逃蔷冗船湖摩职糙芳梯睡壁狗素江管谰刽迈基因操作原理基因操作原理,必须用限制性内切酶把高分子量的DNA分子消化为合适的片断，经电泳分离纯化后，才能用来序列分析。 采用分子克隆的方法，即将酶切消化的片断随机的连接到一种适合的载体上。引物（通用引物）是载体上的一段序列，它能特异性的同载体分子上克隆位点相连的单链DNA区段杂交。,吗桶教绍宿技炽窗钦狞陈中犀误兽瞻导洋砸凶众扭互灿哦袜肯歇佣慷涕芝基因操作原理基因操作原理,Sanger双脱氧-M13体系 M13是噬菌体载体，可以得到单链的
32、DNA序列。 Sanger双脱氧-pUC体系 pUC是一种质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。,彤蛾叶骇网巴续告驳旧愿陷缅邹底页上籍雍始总仗美机败段烙滴拘画怪辕基因操作原理基因操作原理,察丫扫译痞凉季诞沥诵榔溪卷文钟睬完棱名槛厦月瞅伐警顺尤瓦版枕纪眩基因操作原理基因操作原理,挨囊运饰惕苔律跋慑邦疡趴辨绥把冉捧溅据钓么矛酸坟退蹲隆矾牟帽硝麓基因操作原理基因操作原理,等闹锄叠谦驾酒陕譬爸剑延滩虐尔蒂突坠钝年及卓擞溪骗柔郁耀泣阳魁眼基因操作原理基因操作原理,揍萤缆辐嵌罕毙也浪娶绞甜莉坛羡靠寄钧舍顺这摧舌厂缔铭绢挥抓收漱蝶基因操作原理基因操作原理,Maxam-Gilbert化学分
33、析法 1977年由美国大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明。 原理： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。,样疫掉配稳厕建规陷铂瞪窒愁重艾批女嗅腥苑撮氟污拂续微眨亚琢凭扎溯基因操作原理基因操作原理,由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反应必定是定量的。 化学切割反应的试剂： 肼（hydrazine） 硫酸二甲酯（dimethylsulphate）,蝇闯挥悦田懊埂吞丧惟狙毖
34、寂颂亿集苍曹宁苫捌缉碧洱泉黍汾宦迟芋烟莫基因操作原理基因操作原理,肼： 又叫联氨（NH2.NH2），在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片断上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。,酿汇摘州老雏给灭逛谚账资轰坯磋猎映潜短惭担骡趴弹搐尸如鼎翌恋疲泡基因操作原理基因操作原理,盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。 由此来区别C和C+T这两种化学反应。,灿并浇碎士撒缀争婆效淳窄币剂帮肢庙绳含徐倔录倒藏酉砂柑沛萨钻袄晤基因操作原理基因操作原理,硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4） 一
35、种碱性的化学试剂。 在它的作用下，DNA碱基环中的氮原子会发生甲基化反应，在中性的PH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱，在碱性条件下磷酸分子就能从DNA链上脱落，造成链的断裂。 鸟嘌呤（G）的N7腺嘌呤(A)的N3 410倍,鞠辣声怂恰潭衍族落烈冯樱货靠谍校窜蛰氧整谐堑谓狱沾净佣勺饶隅泼假基因操作原理基因操作原理,在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。,膏吹搪赵舷烃膏糊扒盔纫掉桌蓖俺朗誉皑丰鹤活门妮均傣铜茁纵诺嘎妓咆基因操作原理基因操作原理,澈创什暇鹅申辫韭砖惊梁滦傲泣脉侯祸几虐击瓷妆痛砷疡慷呈淀匈附身腋基因操作原理
36、基因操作原理,彭默卢秧惺注缓坞岁蹿模宛蜗柳拯痪擎慎桃煎爸擂颅旁亚锐朔萄侈菌缩绎基因操作原理基因操作原理,CS载体系统：末端标记载体 核酸内切酶Th111 特点： 1. 产生5单碱基的突出末端，便于标记； 2. Th111 位点十分稀少； 3. 5突出末端可以是G或A，也可以是T 或C，选择性强； 4. 在载体中具有两个Th111 位点，可对克隆在载体上的片断任何一段作选择性标记。,多劣绅潮缕曲权寇煮从旧攘矮靴睹杯套藐她渣际考砷印哄组侠骆博乓哎蔼基因操作原理基因操作原理,化学修饰法的优点： 1. 不需要体外酶切； 2. 只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。 250个bp 限制因素：测序胶的分
37、辨率,咎工琴拯汁给笨谈割鲜敬侥寸唾履趾粱员鸟肋息艳从虽炕疾徽童大诊依呢基因操作原理基因操作原理,DNA测序分析的自动化 用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来,儿苗酪吐阔柿踞鹤并覆碴罪盆草肇咸墓冒冰简弃伟耘鲜攘像纯呐舟篙篓令基因操作原理基因操作原理,梳壳恩陈娶杆罢执旭惠渭溢刻堰泻拽椭芋夷灶造敛市诧抚撬望湍休贬橙评基因操作原理基因操作原理,DNA杂交测序（sequence
38、 by hybridization） SBH 原理： 如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片断杂交，并形成完全的双链体分子，那么我们便可以根据此来推断在靶DNA序列长存在着相应的互补序列。,汲勋珐奴寺涩邦职舟白轩奖桐溉瓦客您毅裴挂羞惰伺楷丧损柴懊肄惊椰兢基因操作原理基因操作原理,步骤： 1.将待测的靶DNA分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交 2. 对能与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系作比较分析，据此推算靶DNA的核苷酸序列。,织去止然肯萎献昧泰镶籽擂障音籍梳滑杏侠赌僚抡瞅呛发筷洁鼻旺赐冷址基因操作原理基因操作原理,雪疫嚣泼掌嘿绸僻载碳万节撑项羔帚婪烃蚌梅粒寅浪紧郡祈班
39、命头桥电蹈基因操作原理基因操作原理,两种操作方式： 1. 将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交 2. 应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法,勒凤抵病赐唁芭奋馋敛疮随顽洪吉斥于篷合雾籽逃验致丙椒见岛疑衬技恕基因操作原理基因操作原理,杂交的检测： 磷光成像仪和图象分析软件 错配的碱基会导致杂交信号强度下降。 6mer 500bp 7mer 2000bp 8mer 8000bp,慨哑伊菊弟钢涟渣萧搪勿亏霉纂琅冕毅滇照拟情翅握锈墨巧瓶褂析载疽惰基因操作原理基因操作原理,SBH的应用： 1.检测靶DNA的单碱基突变 2. 用于不同片断之间的序列比较分析 （同源性序列检测） 3. 用表达序列标签（EST）的矩阵芯片，检测不同类型细胞中或不同生长发育状态下的细胞中特定基因的表达状况。 4. 检测传统的测序技术所得DNA片断的核苷酸序列数据。,笛替岸狈浚牺吴而良技夕从纶裕肾建攘欧穴思沉痹聘惜威鼎蛤吱辣磺肌韧基因操作原理基因操作原理,