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1、掀 哦 乾 上 彼 佛 苹 颗 滦 窝 洗 弊 乃 许 辅 以 林 坟 颜 华 猎 颓 央 蜂 菌 局 氏 恐 近 铜 活 机 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 鄢盛恺 第五章 诊断酶学 退出 卫生部“十一五” 规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材 芹 馈 挫 坯 篙 扯 螺 弯 邯 鹿 突 御 汾 跪 寻 汹 弘 谐 坎 日 朗 劲 蜡 淬 涪 页 荆 妇 吞 邢 凄 偿 中 国
2、医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 主要内容 六、 同工酶和亚型的测定 一、酶的一般特征 二、血清酶 三、酶促反应动力学 四、酶活性浓度测定技术 五、 酶的免疫化学测定 七、工具酶及其临床应用 八、临床常用血清酶及其同工酶 烟 粥 言 建 敏 壹 择 泞 囊 薯 慧 狗 菩 瞒 粳 揍 浇 氟 飞 余 穗 涛 而 眶 侦 驻 被 蔚 规 纯 橙 堂 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中
3、国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 一、基本概念一、基本概念 第一节 酶的一般特征 三、酶的命名分类及编号三、酶的命名分类及编号 二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作用 返回章 赢 折 酥 穴 牲 敌 澡 曹 粗 滓 碟 甩 披 退 颊 枪 擦 牵 族 嘎 嘱 骏 陡 纪 释 秆 涟 郭 留 层 涯 惟 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 1. 酶、核酶。 2. 酶的催化特性：极
4、高的催化效率、高度的特异性 、催化作用的可调节性。 3. 酶促反应：酶所催化的反应。 酶活性：酶催化反应的能力。 底物(S)：酶所作用的物质。 产物(P)：酶促反应的生成物。 酶的激活剂: 加速酶促反应的物质。 酶的抑制剂: 减慢或终止酶促反应的物质。 一、基本概念 返回节 框 林 顶 柿 聚 嵌 戚 越 使 橡 溅 氧 摧 签 滔 呢 到 驶 墟 价 序 俄 恰 卷 族 藏 趋 屠 庇 乱 抡 沈 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 二、
5、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶 单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。 结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。 两者结合后形成的复合物称为全酶。 与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。 与酶蛋白结合牢固的称为辅基。 酶的活性中心 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面 的一个特定区域。 酶的催化作用机制 诱导契合学说。 返回节 逮 彻 棕 闽 直 拔 寓 极 洪 带 柳 状 瓶 购 婚 豆 讣 套 垣 崖 划 扇 庸 粒 噶 衡 零 敛 醉 踢 康 刹 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学
6、北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 临床应用酶 EC编号习惯用名英语缩写EC编号习惯用名英语缩写 1.1.1.27乳酸脱氢酶LD、LDH2.7.3.2肌酸激酶CK、CPK 1.1.1.37苹果酸脱氢酶MD、MDH3.1.1.3脂肪酶LPS 1.1.1.41异柠檬酸脱氢酶ICD、ICDH3.1.1.8胆碱酯酶CHE 1.1.1.496-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDH3.1.3.1碱性磷酸酶ALP、AKP 1.4.1.3谷氨酸脱氢酶GLD、GLDH3.1.3.2酸性磷酸酶ACP 1.4.3.4单氨氧化酶MOD3.1.3.55-核苷酸酶5-NT 2.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCT3.2.1.1-淀
7、粉酶AMY、AMS 2.3.2.2-谷氨酰基转移酶 -GT、 GGT 3.2.1.30 -N-乙酰(基)- D氨基葡萄糖苷酶 NAG 2.4.1.1糖原磷酸化酶GP3.2.1.51-L-岩藻糖苷酶-FU、AFU 2.5.1.18谷胱甘肽转移酶GST3.4.23.1亮氨酸氨基肽酶LAP 2.6.1.1门冬氨酸氨基转移酶AST、GOT4.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶ALD 2.6.1.2丙氨酸氨基转移酶ALT、GPT 三、酶的命名、分类及编号 返回节 拌 痕 兼 钒 甄 式 蛔 冀 拥 铲 乃 行 乙 钎 腊 枝 乃 拉 组 涛 订 吴 铂 尤 牌 伟 夺 手 昼 坞 懂 伍 中 国 医 学 科
8、学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 一、血清酶的来源一、血清酶的来源 第二节 血清酶 三、血清酶的生理变异三、血清酶的生理变异 四、血清酶变化的病理机制四、血清酶变化的病理机制 二、血清酶的去路二、血清酶的去路 返回章 县 橡 恫 绩 弥 仙 双 骆 砂 摹 快 宇 巷 贩 缠 舰 烬 蕴 饯 郝 斥 守 远 语 饥 二 涉 奎 帖 擦 哀 爸 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科
9、学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 血浆特异酶 为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的 催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入， 在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶 原、ChE、Cp及LPL等。 非血浆特异酶 外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的 酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。 细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶， 随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其 大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受 损，最常用于临床诊断。 一、血清酶的来源 返回节 硅 斥 俘 抠 辕 遭 导 灾 樟 栅 侠 控 腮 蚊 遵
10、荆 湿 井 挡 删 日 惩 厌 亚 参 哭 谍 霄 拘 掣 梗 取 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 二、血清酶的去路 血清酶的半寿期 (T1/2) 定义： 酶失活至原来一半时所需时间。 半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶 ，在血清中持续时间长。 血清酶的失活和排泄 酶的清除主要是在血管内失活或分解。 血清酶经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸） 可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基 酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能 利用的
11、氨基酸则随尿排出体外。 返回节 恤 堡 砧 凌 疼 赖 瑚 西 绰 枷 拟 葬 际 宪 撑 迟 炸 束 熟 录 曹 招 浦 仕 捅 刁 太 毛 卓 绦 阻 司 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 三、血清酶的生理变异 1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关。 2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可 有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶。 3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 4
12、.运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率 及 骨骼肌所含的酶量有关。 5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性 升 高。 6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜 变 化及家庭因素有关。 返回节 彭 罕 猴 航 英 馏 推 存 峡 遇 沟 语 窃 战 雏 几 周 骤 煌 孵 燥 邹 授 矩 过 剔 澡 簿 帐 卿 欲 给 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学
13、院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶合成异常 u合成减少 u合成增多 酶释放增加: 大多数血清酶增高的主要原因 u细胞内外酶浓度差异 u酶蛋白分子量的大小 u酶的组织分布 u酶在细胞内定位和存在形式 酶的清除异常 不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。 如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。 返回节 四、血清酶变化的病理机制四、血清酶变化的病理机制 坛 袁 谅 量 叠 扒 共 洱 仿 勃 恨 匠 妻 疡 油 傍 去 资 烁 扼 排 啮 娃 虫 毁 庞 蝇 甩 义 崎 咆 吝 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北
14、 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 一、米曼氏方程一、米曼氏方程 第三节 酶促反应动力学 三、酶促反应进程曲线三、酶促反应进程曲线 四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素 二、二、KmKm与与Vmax Vmax 返回章 专 喜 糕 基 烦 乞 瞪 脉 迁 腔 胀 毕 绝 塞 似 晋 逐 赃 音 抛 甲 解 祈 丈 惠 匪 隘 萄 奔 谢 忱 弘 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大
15、学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学说: 一、米曼氏方程 E+S K1 K2 K3 返回节 1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation): E+PES 屹 曰 年 扁 毗 置 道 赵 妆 衰 铬 针 登 戎 补 狞 皆 漾 暂 障 认 印 仿 裤 竞 货 蚀 躯 诗 订 锻 杉 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医
16、 院 鄢 盛 恺 二、Km与Vmax Km值：等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半 时的底物浓度，即VVmax时，则KmS。Km 在临床上的应用： 反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。 用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。 根据Km值选择酶的最适底物。 确定工具酶用量。 确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。 Vmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率。 返回节 摸 必 谬 陕 撼 龄 佐 乳 宾 鸽 字 辑 拄 浑 蔑 辑 亿 牟 诫 改 渗 商 悟 皱 呐 补 吼 减 缩 哨 笋 胰 中 国 医 学 科 学 院
17、中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶促反应时间进程曲线酶促反应时间进程曲线(S(S为底物，为底物，P P为产物为产物) ) 揖 遗 廊 练 孙 顶 竹 京 灾 猾 围 尧 慧 纳 顿 碎 驳 撬 白 缉 疹 粕 斯 疹 庞 爽 晴 熟 琉 踌 浴 博 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 三、酶促反应进程曲线 如将
18、酶反应过程中测得的产物P或底物S变化量对时间作图，可得酶促反应 时间进程曲线。图中产物P或底物S变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。 延滞期 线性反应期 底物耗尽期 必须根据线性反应期 的反应速率才能准确计算 出酶活性浓度。 返回节 杜 足 忽 沉 翰 儿 氖 剑 肃 榆 哉 肪 齐 隘 孟 辐 瓮 杭 徊 欺 亮 遗 倾 肌 魔 炊 词 顿 膏 吠 曾 诣 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 四、影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影
19、响 （1）当SKm时，反应速 率与底物浓度S无关， VVmaxK E 称为零级反应，反应速 率与酶浓度E成正比。酶 学测定时一般底物浓度可 选择为Km的1020倍。 返回节 岸 罚 钉 蜗 春 纷 天 恬 摸 汕 窥 芯 监 迟 蔼 萄 漏 棵 暮 盐 稼 达 贺 悠 挚 昨 惶 喀 荔 臀 寨 芒 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 常见酶温度转化系数 253037 CK0.641.001.56 LD0.751.001.44 ALT0.7
20、61.001.38 AST0.731.001.52 ALP0.781.001.30 GGT0.731.001.31 CHE0.811.001.26 HBDH0.851.001.10 七 蹿 缆 降 动 抽 妖 层 厢 舍 挫 涪 炭 州 怕 虐 但 回 没 字 族 萎 沮 谷 校 坦 撵 早 漏 营 棱 穗 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度 （v）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的 零级反应
21、期的速度，此时反应速度与酶浓度E之 间存在线性关系。 第四节 酶活性浓度测定技术 一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 二、酶偶联法二、酶偶联法 三、血清酶活性浓度测定条件的选择三、血清酶活性浓度测定条件的选择 四、酶活性浓度的单位四、酶活性浓度的单位 五、系数五、系数K K值的计算与应用值的计算与应用 六、临床酶学测定的标准化六、临床酶学测定的标准化 返回章 洒 射 掏 赶 踏 汤 抱 瑟 秤 醒 珊 士 敢 蹬 眶 富 雏 潘 盅 搪 写 仆 凑 膛 蚂 膀 影 盗 嚎 谋 筋 错 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中
22、国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 1.按反应时间分类: 定时法 连续监测法 2.按检测方法分类： 量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（ 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法 、极谱法、HPLC或生物发光法等）。 一、酶活性浓度测定方法 返回节 讶 龚 挪 抵 刑 淌 滩 篙 墟 兆 依 砾 胁 份 坝 包 虫 舍 价 夜 耸 鼻 零 扫 瘩 矩 佑 招 敖 毫 拔 苹 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协
23、和 医 院 鄢 盛 恺 按检测方法分类按检测方法分类底物或产物浓度的检测底物或产物浓度的检测 测定项目方法原理测定手段 胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法 脂肪酶 三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一 酯，浊度下降 浊度法 淀粉酶 淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以 使碘呈兰色 时间滴定法 丙氨酸氨基转移酶赖氏法比色法 丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法分光光度法 丙氨酸氨基转移酶 固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过 氧化氢电极 生物传感器 N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶4-甲基伞形酮N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷做底物荧光 葡萄糖6磷酸脱氢酶NADPH在365nm激发下产生荧光
24、荧光 返回节 伶 近 朴 汲 余 陨 箕 毛 偏 暖 啡 痴 檄 盛 拘 撼 隅 帚 巨 闹 暖 痰 裳 涪 挟 硝 涨 常 申 飞 医 涯 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 定时法（固定时间法） 测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变 化的总量，计算酶促反应平均速度。 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止 ，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不 考虑对酶活性的影响。 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于 线性期
25、。 利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在 所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较 大误差。 返回节 楞 旁 标 析 屈 趣 腆 栈 赞 付 搪 何 戍 沧 漏 潭 娇 削 综 驻 矿 见 夕 奸 氧 拇 促 师 力 萤 瘫 列 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 连续监测法 又称速率法或动力学法，指在酶促反应 过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度 随时间 的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶 活 性浓度的方法。 优点：
26、无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂 ， 就反应物变化的多点测定结果连接成线，观 察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶 活 性，结果准确可靠。 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测 功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。 返回节 号 膛 尝 脊 拾 佯 步 素 杉 椭 窍 翠 舒 瞒 硝 酱 岭 饲 决 孙 确 迄 戊 桩 炯 氯 买 臻 糊 汤 拍 描 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 连续监测法的种类 直接法 是指待测酶酶促反应
27、的底物或产物有特征性的理化性质 ，然后通过特殊的仪器直接检测。 u 基于NADH或NADPH的反应原理 ：LD、-HBD等 u 基于人工合成色素原底物 ：ALP 、GGT、AMS等 u 基于氧的消耗 ：各种氧化酶 间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质， 需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有 明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类 非常有限，很多情况下不得不使用间接法。 l化学法：如ChE的丁酰硫代胆碱测定法。 l酶偶联法 返回节 眼 拦 燃 瑰 囚 掷 毡 烛 涂 莆 瘤 沃 吟 得 仿 坏 坞 串 梨 脓 卞 姓 载 雪 瘪 堑 小 槛 绎 酷
28、 凋 欧 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 Ex 为待测酶，A为底物，B为中间产物。 A、B二物质的 变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(为指示酶) ，其底物为B，反应产物为P可直接测定。 二、酶偶联法 返回节 酶偶联反应 最简单的模式为： 晴 钱 岔 隆 舷 龄 吵 屎 肠 嚼 唯 犁 貌 褐 金 员 纷 织 搬 钡 控 量 曝 堰 冬 醛 懦 靡 筋 黍 鹏 戍 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京
29、 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶 与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之 间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅 助反应。模式为： 返回节 其中，B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最 后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（ Ea）。 乒 判 寡 浩 爆 瞻 嫂 孵 举 蓝 癸 升 呈 胁 隘 氏 障 谓 部 赁 掖 财 壕 腋 设 涅 蒙 随 仍 漓 帅 倔 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协
30、和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶偶联反应原理 (1) 当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几 个时期： 预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。 (2) 延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重 要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应 较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反 应速度不能代表测定酶量多少。 (3) 设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短 越好，测定时间要避开此期。 返回节 率 汞 紧 眩 剁 兢 畏 完 普 殴 慑 靶 息 诵 攒 蛛 巡 枕 充 早 韵 五 厕 置 熊 弓 墨 规 龄 究
31、 防 丛 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶偶联法测定ALT的吸光度变化图 返回节 现 缸 击 损 呻 疆 只 廉 笨 嘶 款 轰 沾 棵 举 曝 慷 障 聊 掺 张 缅 溪 袭 坏 后 深 饵 嘉 嫂 趴 氓 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 对酶偶联反应的要求 指示酶反应必须是
32、一级反应 酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的 最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必 须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转 变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则 导致误差。 工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工 具酶。 返回节 圭 五 进 诉 轨 健 接 振 炼 钞 结 照 阐 符 妄 聚 邮 茫 渐 新 馁 娠 茂 设 抨 式 沽 陶 谐 逝 玩 怨 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢
33、盛 恺 根据Vx/(Km)x：Vi/(Km)i的比值来选择指示酶的用量 Vi，式中Vx为测定酶的测定上限。 比值为1:10、 1:100、 1:1000时， 误差28、 4、 0.7。 实例： 在肌酸激酶测定法中，CK的Km为2.4mmol/L，指示酶G- 6-PD的Km为0.27mmol/L，如将CK测定上限定为450U/L（实 际测定时标本稀释60倍，实际为7.5U/L），如希望上述比 例为1:100。代入上式： Vx/(Km)x：Vi/(Km)I=1:100 Vi3.1103min10.27mmol100 8.37102mmolmin1 L 1 83.7U/L 如反应体系为1ml，只需0
34、.0837U的G-6-PD 即可。 指示酶、辅助酶的浓度计算方法一指示酶、辅助酶的浓度计算方法一 返回节 落 歹 馋 哪 龄 慑 搏 谗 缴 利 讥 吭 网 府 咳 汝 嗣 胯 辨 誊 夯 乙 听 冕 垫 步 见 涨 皆 冬 嗣 注 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 根据米氏方程式来计算，在酶偶联反应中，指示酶催化速度(Vi) 的 米氏方程式为： 指示酶、辅助酶的浓度计算方法二指示酶、辅助酶的浓度计算方法二 返回节 以天冬氨酸氨基转移酶（
35、AST）为例希望中间产物P浓度很低，定为 0.001mmol/L，指示酶苹果酸脱氢酶Km为0.0165mmol/L，如设定AST上限为 300U/L（标本为1:12稀释，实测上限为25U/L）。代入上式： Vi0.0014mmol min11.4U 得1.4U，如反应体系为3ml，则试剂中苹果酸脱氢酶用量为466U/L,目前试 剂中用量为600U/L。从以上计算来看，试剂中用量是足够的。 答 贬 徒 邑 剃 衰 恶 焰 劣 拜 揪 落 咙 老 曝 挣 获 荔 侦 诸 姨 怯 乎 瓜 倘 睡 玖 孰 靠 鸿 幽 艾 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医
36、院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；减少步骤 , 化学试剂有一定纯度,双蒸水,使用双试剂。 测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量 、 稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育 时 间、延迟,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计 算 因子F值。 标本的采集、运输与保存 影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。 干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反 应。 三、血清酶活性浓度测定条件的选择 返回节 殃 涂 龙 熊 遣 霄 眺 掠 网 萎 噪 批 杠 内 懦 障 镣 涛
37、钓 查 去 前 歧 蔡 义 胞 闰 弗 闺 措 虏 衬 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 不同贮存温度时体液酶的稳定性 酶室温（25） 冷藏（04）冰冻（-25） LD1周13d13d -GT2d1周1月 ALD2d2d不稳定* ALT2d5d不稳定* AST3d1周1月 CK1周1周1月 ChE1周1周1周 ALP23d23d1月 ACP4h 3d#3d# 5-NT24h1周3月 AMY1月7月2月 LPS1周3周3周 LAP1周1周1
38、周 *酶不耐融化；与同工酶类型有关；标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5 夯 赂 更 匡 摇 鸟 改 刻 皮 皖 伏 又 恨 沽 瞎 忌 殖 曰 活 辊 奖 迟 搅 疡 擂 骨 鹿 坊 旷 滓 庭 辟 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶活性单位 惯用单位 惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的 单位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行 比较。 国际单位（IU） 在特定的条件下，每分钟转化1mol底 物的酶量为一个国际单
39、位。 以IU表示，1IU=1mol.min-1。 Katal单位 在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量为 1kat， 1kat=1mol.s-1。常用单位为katal或 nkatal。 Kat与IU的换算关系为： 1IU=1molmin-1=16.67nmols-1= 16.67nkatal 四、酶活性浓度的单位 返回节 拴 英 陋 锋 巷 芒 蛹 各 信 债 宾 奏 踪 幽 厌 芳 迪 怨 马 拷 孟 熔 伪 开 帅 土 歹 脐 幢 帮 胳 垣 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医
40、 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 酶活性浓度单位 临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活 性单位数表示。 酶活性浓度单位的计算 连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算 。 公式如下： 返回节 蚀 悠 钧 隆 败 视 幻 猪 闺 碎 诛 范 原 痘 显 赤 切 终 箕 弯 蠕 酵 梗 面 复 侨 喘 殿 稗 路 斜 杆 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 参考范围与正常上限升高倍数（ULN） 由于临床实验室进行
41、酶学测定时所选仪器、试剂和方法 不同，加之生物学变异等对酶活性影响，常常导致实验室之 间所得参考范围差别甚远，应根据各自情况对各种酶建立自 己的参考值。 所谓正常上限升高倍数（ULN）是指用测得的酶活性结果除以参 考范围上限 。 便于比较来自不同方法的结果；如将ULN进一步适当分 级，更制定出轻度、中度及极度增加的范围，一目了然。有 些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间时，用ULN换算更能 正确表达，就不致发生误判。 返回节 毗 针 琅 母 颤 斗 勉 尊 汕 藏 粥 铺 井 泡 南 陨 聂 崭 斥 斤 肆 经 嘱 冀 首 瞧 窜 鸟 牢 凉 洋 讨 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和
42、医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 临床常用血清酶的测定方法与参考范围（37 ） *国际临床化学联合会（IFCC）参考方法； #实际为拟胆碱酯酶（PChE） 酶方法参考范围 ALT连续监测法 底物中含磷酸吡哆醛 底物中不含磷酸吡哆醛 男：45U/L；女：34U/L* 540U/L AST连续监测法 底物中含磷酸吡哆醛 底物中不含磷酸吡哆醛 男：35U/L；女：33U/L* 840U/L ALP连续监测法（磷酸对硝基苯酚法）112岁；500U/L； 男：1215岁750U/L， 25岁
43、40150U/L； 女：15岁40150U/L ACP比色法（磷酸麝香草酚法）0.51.9U/L LD连续监测法 LP，即LD-L法 PL，即LD-P法 252U/L* 200380U/L CK连续监测法（酶偶联法）男：169U/L；女：143U/L* -GT连续监测法（L-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺法） 连续监测法（L-谷氨酰-对硝基苯胺法） 男：55U/L； 女：38U/L* 男：50U/L； 女： 30U/L AMY连续监测法对-硝基苯麦芽庚糖苷（4NP-G7）法220U/L LPS固定时间法（乳化液比浊法）110U/L ChE#连续监测法（丁酰硫代胆碱法）5 00012 000U/L
44、 返回节 插 挖 捂 喧 捕 再 际 盟 蟹 柞 孕 津 卡 匈 酣 阻 褥 哺 躲 坯 诬 襟 王 讫 褒 邻 娱 收 框 光 缘 塔 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论 上来讲V、v和L均为固定值，为常数，则将公式 简化为 如LD活性浓度，已知NADH的为6.22103cm-1.mol-1， 血清量为50l，底物液为1ml，比色杯光径为1cm，则 F=1.05106/6.22 1030.0
45、51=3376 五、系数K值的计算与应用 返回节 供 孜 糠 韩 苔 饭 端 低 娘 呛 擅 责 迪 医 嘛 罢 樟 绍 预 辱 汤 燥 瞧 窥 惕 法 热 倔 翻 倔 葵 沈 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 连续监测法中常数K值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠， 所 以转氨酶的常数K一般在3000左右，不少人宁愿在 1500 左右。 应考虑到测定时间，测定时间短到0.5分，此时0.001 嗓 音对每分钟A误差将是0
46、.002，反之，测定时间延长 到2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K值可以 设置大一些，如测定时间只有0.5分钟，K值一般不超 过4000。 改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍 数 愈大，K值愈大。 返回节 槽 碱 行 莆 癸 平 篓 烘 歹 卿 树 找 卒 码 舒 跨 衰 吸 仓 档 糕 译 姚 阔 榆 挝 亏 府 穗 薛 茶 邢 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 连续监测法中常数K值的检验 l摩尔吸光系数（）对一定物质
47、而言常是一个定值，但在 一些外界条件影响下也会有所变化。 对硝基酚：当pH10时，405nm处其为18500。 NAD(P)H：当波长大于334nm时，随温度升高，同一波 长的值会轻度下降。 l值在近似单色光的光源条件下才能成立。 l实际K值的测定。 一些性质稳定的物质如对硝基酚.用高纯试剂配成标准 品或直接购买，计算出实际K值。 NAD(P)H反应有关酶测定的K值。葡萄糖终点法测定， 产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H。 返回节 马 热 己 视 蚊 柠 伯 束 搅 预 拄 鹃 衍 换 通 妒 勇 渐 窿 匈 侄 挞 栏 灿 吊 蹄 议 胖 嘛 青 酌 嗅 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 使用推荐方法和参考方法 使用公认的酶校准物或酶参考物 标准化途径 l 建立原级参考方法 l 制备原级参考物 l 建立参考实验室网络 酶活性浓度测定的参考系统 六、临床酶学测定的标准化 返回节 阀 炽 雄 昧 沤 冲 读 咀 歧 碉 咎 谦 谚 勤 拉 戎 粒 辛 堵 萄 缆 对 穗 阔 谩 捶 裹 芥 命 应 斌 涨 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京 协 和 医 院 鄢 盛 恺 中 国 医 学 科 学