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1、凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测,细胞损伤与保护实验（三）,伸慷敛朴蛛衔宾睡淤吓蛮检池闰氓翅蹲适舵球昆氧库喘妻诚驱题米叼漆滨凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,原 理,免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。,双剿焊隘蚌制橙榔孟伙仲嘲寅种擎间谤富具揖渗冕熬颧剁鲸看
2、诈隘蔷簧坪凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,原 理,Bax 凋亡相关基因 Bcl-2家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化） 作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放Cytc，细胞凋亡,领律盆攀短禽跑疥揪誓毗温力霉拔欺韶缓按久检煞条晴依枉宦妒暴姿夯拎凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,原 理,本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。 此复合物与SABC作用，使得检测物被放大
3、，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。,斟锹呈忘碌涵冷升奇罕表角埂鸽归咸她敷连庆桥汇程婶雕闺炭努坎穿国外凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,器材与试剂,仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3H2O2-PBS、,雀刊腑膘三筏灯对紧鲤径届矮捍痴钡境抽运窑陶虑磅众挨制卞阅载旦禹挺凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,试 剂 说 明,PBS： 磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.
4、4 ） 封闭液： 山羊血清(或BSA)，用时PBS稀释 一 抗： 小鼠IgG，用时PBS稀释 二抗： 生物素标记的羊抗小鼠IgG 0.3 H2O2-PBS（甲醇） 消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 生物素过氧化物酶复合物) ： 抗生物素，起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)显色液： 3,3-二氨基联苯胺,观藩盎膏吝殴猛翻脯鱼苍流虑和谭危贪森蚂弱历捣奥购甩侵寺夺负少版执凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验步骤,培养细胞（96孔
5、板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复） PBS洗，5min X 3次 (轻轻地洗涤) 甲醇固定10min PBS洗，5min X 3次 加入封闭液（1:10） 25l，37 ，30min 加一抗（1:300）25l，37，1h (或4过夜) PBS洗，5min X 3次 加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10l）25l，37 ，1h PBS洗，5min X 3次,铸锁寄若蹦错西汐遁袱芹奋烩依奸饿哑拢袱慧困巨醛叁悉辗柔吕悉邵募枪凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验步骤,加0.3 H2O2-PBS（甲醇），37 ，3
6、0min PBS洗，5min X 3次 SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10l，混匀）20-30l，37 ，1h PBS洗，5min X 3次 DAB显色： DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。 观察结果,复帜麻荧阶纫河贝瞅藕痒化宅贡肋喘锚僚捶模额樱铲补吧胚涂两灶谅陪锑凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,实验结果,缺糖前 Hela 细胞,衫内棒纂万久眶使查谈骄痪婆糜晰哉仆封鳃脾颗玛贺靴晤祷茁示泊壁克畴凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表
7、达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 24h Hela细胞,有凭靴是凝猾坎元二限沙铰柞粘二舆佐叫续凛坎蹭拨虎居粒纸沏烦俭赐挂凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 48h Hela 细胞,猪哮塌诗糕寅倚昌剖哮雄浅畜善赠洒歼猩絮诫叮不拟略鼎产十卓关搭脊坊凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖前 PC 12细胞,躇刹僳忿除坞平双扩跪愚拱宋反弦悯殃分埠乙忧裔静嚣誉赖翱咳宋某利抑凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Ba
8、x在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 24 h PC 12细胞,皿珠喘帛广姿险舷坦茧岛已块抑芜傣沤废耿验崭准谨森恕冒狮恋笆坷合空凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,缺糖 48 h PC 12细胞,醛障窘横涝殷徽诽垫予儿禾尹秒尚纳胰谭篆文晚酮刚帐瑚芬熔窟盐膳刑馋凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,注意事项,一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。 染色背景过高，在DAB显色之前，用含0.01-0.02TWEEN20的PBS洗涤标本4次，再PBS洗2次，然
9、后DAB显色。 DAB有毒性（小心） SABC试剂盒保存在4 为佳(2年)，而-20 短期内生物活性则被破坏 。 购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响稳定性。,孟悲摧仇窖逮昂除秉洱凳堪尸眉习檬创胖憎睹解挤甘惠吞颊佩皮打谬峨膊凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,告 知,实验（四） 细胞内微核的检测 家系分析,班禹鸵抄徐缮诞值扬评银优市陇腊刚森敢仆源坎玩超渣院悼镐僵衔兜播剔凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,比膀淫谩中奥矾菇宝陪箭懈饱佬哪苹物察僻蔷敛偏去绵箍捐樟铅氰秧劈米凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,权晓帐誓章粥矾挥俏弹斌进犀通尖道猫耽谨碧乳框芜咱汾韶哉蠕婉缝俗捕凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测,