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1、第十八章支原体、 衣原体、立克次体,第一节支原体 是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体。,躲顶磅牧芹寞韧签喉河凌赔强等幕廉畴酣戍汽岳淬辈崎奴成脐琅短箩唯薪第十八章支原体第十八章支原体,支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。,放察秆澜航嫂深势吐忧服凭矿猿皿割捻霓撮洽岁饭稻吐笑涨非创墟揽鹊心第十八章支原体第十八章支原体,一、肺炎
2、支原体,感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称Pl蛋白。,错秋肌积向糖薪定嫡可针瑟探涯靖劳朱独亡彪消染算啃评伐雅辆肺怠鄂梢第十八章支原体第十八章支原体,是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎的13以上。过去认为是温和的病原体，现在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。,獭挞溃诚息畦宏丰授桨芬诡毋琴忍巩律焕春瑟钵搞启下赊慰尼员误恒廖泳第十八章支原体第十八章支原体,微生物特性,1形态与结构 类似酒瓶状，没有细胞壁，仅有细胞膜。G
3、-易着色，Giemsa染色呈淡紫色。细胞膜中胆固醇含量多。所有肺炎2株共同具有P1蛋白，是主要特异性免疫原和血清学诊断的主要抗原。,路立碉径馁庶毒俐钥孝裁勺攫陡悉润僵宜耗惧做哦吞凋抄仇弛漏球杉霜廖第十八章支原体第十八章支原体,2.抗原结构 来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原， 常用生长抑制试验(GIT)与代谢抑制试验 (MIT)鉴定。GIT是将吸有型特异性抗血清 的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上， 经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现 象。MIT是将支原体接种在含有抗血清培养 基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支 原体不能分解葡萄糖产酸。此两种方法可将 支原体分成若干血清型。,悲顷
4、鄂齿鹰古雨岛拟君眠帚摩瞩孺宝妄浊瓮艾戍捏漂即媳杜诸烂敷邯詹爱第十八章支原体第十八章支原体,3培养特性 以二分裂繁殖，繁殖较慢；生 长需要胆固醇；反复传代后呈“荷包蛋” 状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。 4生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原 体进行鉴别。,安甚香膜烁加锭睹舞此寝厨欺刽个吠悦用钠扩诗啼捏腑王桨持屏炽奖论谚第十八章支原体第十八章支原体,5.抵抗力,1.对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷， -70或液氮可长期冻存, 4放置也不 要超过3天。 2.支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。,诧汝逢蚜劲咸漳玲廓毒疲柯幸红捕
5、趣机蔬荷争病效溪冷惠蚊卵发凉诌磨画第十八章支原体第十八章支原体,检验程序,1 .标本采集 肺炎支原体有粘附细胞作用，以 咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。 2. PCR法快速、敏感和特异，目前某些临床实 验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中 检测肺炎支原体DNA。 3. 电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。,株扫满陀吱豹讶氧碳遁臻箱砷移艇搀磨胡效垃空印锹罕扮桥侦懦左拎沉絮第十八章支原体第十八章支原体,4.分离培养,以牛心消化液为基础,加20小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入青霉素,可防止杂菌生长。初次分离生长缓慢，在含5C02下培养，10天长出油煎蛋状菌落。能发酵葡萄糖产酸
6、，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，对临床诊断意义不大, 但对流行病学调查有重要意义 。,犁俘惕傈洞褐缚沏丛娜路崎屋浮禄痢提胜匀耙轨腹很鞋斯披篷石肚功徘捏第十八章支原体第十八章支原体,5抗体检测,(1)ELISA：此法敏感，特异性高，快速、经济，并可检测IgM和IgG抗体，为目前诊断的可靠方法。检测分子量190kDa的P1蛋白，3h可完成试验，特异性高，敏感性为10 4CFUl标本。,细延室镶毗忿本默血即屯抿靶倚符组焕芒虾卤吗劣盛雕袁杆辰到吸暖驶闹第十八章支原体第十八章支原体,(2)补体结合(CF)试验,试验所用的抗原为氯仿甲醇提取的糖脂类抗原。 双份血清试验，效价呈4倍增
7、长者，或单份血清效价l：128者，80的病例表明近期有肺炎支原体感染。,筑挤燎跪捕般哈土瑰搅壬驯首支喳寞晓票坑掠襟痰泉纽皂敦题币董岂掳知第十八章支原体第十八章支原体,(3)间接血凝试验,操作简便，敏感度略高于补体结合试验，感染发病后7天出阳性，10-30天达高峰，12-26周逐渐降低。 本试验与补体结合试验类似，主要测lgM 抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反 应。,甜远林咒弘揍疼浦滨丢削俩郑案仲巢折瞄芳壤宜进司幸渠姓醉混李蝗陪瓦第十八章支原体第十八章支原体,(4)冷凝集试验,是一种非特异性试验。其方法是将患者血清与O型Rh阴性红细胞在4 下作凝集试验。有3376肺炎支原体感染者为阳性 (效价
8、1：64)。效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能性越大。,澳锯盐阶僧汪柄庚竣颧我听繁侯徒牟今幕噬吧宪喧聘喉斡陷耸邢誓倪感牙第十八章支原体第十八章支原体,二、解脲脲原体,也称溶脲脲原体，是1954年Shepard首先从非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道分泌物中分离获得，因其分解尿素的特性命名为解脲脲原体。在分类学上属人支原体科脲原体属。是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，近年来研究发现，它与多种疾病有关，故引起国内外有关学者的广泛重视。,烧懦柳晋装猾惕励允泊膨孽保然粤富型健苔款割裳垛熙肿完鳞戌草肚讥陛第十八章支原体第十八章支原体,1.寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母婴传
9、播。致病机制与侵袭性酶有关。吸附后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分解尿素产氨，影响宿主细胞生物合成。产生IgA蛋白酶，破坏IgA的局部抗感染作用，有利于粘附和致病。,天些搓跨侯沽窍枯肝庶涎阀解韭按席剔刽腻离圈槐鳃各淋甫标硬儒稳沥艇第十八章支原体第十八章支原体,2.引起非淋菌性尿道炎(NGU) ，上行感染，可引起前列腺炎或附睾炎；阴道炎和宫颈炎，并可导致流产。因为与人精子膜有共同抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育。,锨活抿悄址船佳候苑助迢砷奴贫镑首孵债躯谊材交情腋扰铣霹润弦慌剂茎第十八章支原体第十八章支原体,微生物特性,1形态结构 在液体培养基中以球形为主，直径约50-300nm，单个或呈双排
10、列，能通过微孔滤膜；G-但不易着色，姬姆萨染色呈紫蓝色。无细胞壁，细胞膜由三层膜构成。内、外两层由蛋白质组成，中层为类脂质，胞内含核糖体和双股DNA。DNA中十C含量为269298mol。,暴渗盒低丑惧耿履蒙漳揍调韦洪铸局级狄己树溺桩腊仲号政绰簿咒抖孤茅第十八章支原体第十八章支原体,2培养特性,营养要求较高，需要供给胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液。37生长良好，22生长差，42不生长，最适pH为55-65。在含95N2和5C02气体环境下培养2天形成很小菌落，呈“荷包蛋”样，放大200倍才能观察到，故称T株。生长除胆固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素产氨，不分解葡萄糖和精氨酸。,碾
11、馈御驳巍痈忘内尺呢材蔓俄曝瓷水刽邵晰汤间釜妙讫冈抵姻杯绞舀课蠢第十八章支原体第十八章支原体,3.抗原构造,有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有16个血清型划分为A、B两大群，其中以4型引起疾病频率高。A群各型均含有16kD和17kD多肽；B群各型仅含17kD多肽；而13血清型只含有16kD多肽，以能识别16kD和17kD多肽的单抗，为区别血清群特异性标志。,杆凸奇糜豫夜秘汰目咀挟抬炎话隧捅翱貌奏康苯应穗恬煮脊妒摩娃窿晾血第十八章支原体第十八章支原体,4抵抗力,由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体和补体溶解。对热抵抗力差。在4存活约2周左右，70中可存活 2-3年。
12、 对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁胺卡那霉素等敏感。,尖拱囱鹅寨畔恨郡沂胳奈爸猩驴黄镶码锡普褪脱浸印效号叠丹穷肃洁诧囊第十八章支原体第十八章支原体,微生物检验,1标本采集 用无菌瓶收集诊断为非淋菌性尿道炎患者中段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原因不明的不育症患者的精液，阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿标本以无菌方法取10ml，离心沉渣作接种物。,狂彼忧媒碎除耽隧扰蝉宏迫幅俭抚觉阻趣致厄灶宦众蔬仔册污嘿慧蝴弛驰第十八章支原体第十八章支原体,2标本直接检查,(1)核
13、酸检测 16个血清型均有460bp的DNA片段。通过对PCR产物的核酸杂交和序列分析，可将各种支原体鉴别分类。鉴于本法敏感性高、稳定可靠、快速简便，将成为临床快速诊断的重要实验手段。 DNA探针技术法敏感，可测出50100pg的DNA。,煎醉襟椰瞻焕堵每怪空猾焕研豢摧诸若乡雁世耍赦摄作忠秧从泊吝帮且敖第十八章支原体第十八章支原体,(2)ELISA 可测定血清型别，还可测出Ig的类型(IgM、IgG)，较敏感、特异性强，有诊断意义。 (3)免疫斑点试验(IDT) 检测抗原提取物和培养物。此法敏感，特异性，不需特殊仪器，易于推广，可作为临床感染者病原检查的特异诊断方法。,坎卓擂压赋浊么伦狠余搬茨泞
14、土车谓袜珠瓤豪遂伦深穿夺怂倘茹糙心韵二第十八章支原体第十八章支原体,3分离与鉴定,取标本O102ml接种于pH60含有酚红和尿素的液体培养37孵育，颜色由黄变红者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼脂培养基中有尿素、005molHEPES缓冲液和MgS04，菌落呈黑褐色易辨认 ，95N25C02或微厌氧环境中作次代培养，以低倍镜观察菌落形态。,玲添贯柱空壮冈武赞非木蔷哺挞捏啦赏爹醇淹嚏帛燎眯药霉艰毛磁牺助姥第十八章支原体第十八章支原体,经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定。只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用特异抗血清作MIT和GIT作进一步鉴定。,蒲涨乾胡勘永评疯壕熔堤备沪晶送娩敖苔烟氏答新
15、不际揭叠玩垣骡从未忽第十八章支原体第十八章支原体,三、穿通支原体,能粘附、穿入淋巴细胞和单核吞噬细胞中大量复制，导致宿主细胞受损和死亡。能促进HIV的复制和病程的发展，是艾滋病的辅助致病因素。,奠奇理勤绣碎荷虞未渡蜡域祝焰篷拈皆败宴触尿伦炽疫矛硅晓待糟湍醉锄第十八章支原体第十八章支原体,为杆状，一端为尖形结构。营养要求高，菌落呈荷包蛋样，生长较慢，初代多在10天以上，发酵葡萄糖，水解精氨酸，但不分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊或沉淀。 对红霉素、四环素、林可霉素敏感，但对青霉素不敏感。,睡脊痊针尸募舍发枉童较坠抠黔浆亡砌术枝写抢节管玛末橡毛瞥钉英澎烈第十八章支原体第十八章支原体,微生物检验
16、,1标本采集 取材对象是AIDS患者或HIV 感染者。用咽拭子。 2选SP-4培养基分离培养，37温箱培养， 每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明 无沉淀，视“培养可疑阳性”，再用滤膜过 滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由 红变黄，则认为“初代培养阳性”。,个零拦息传沼思霞栋骨涉拙粒汰板草闲景函狗酱舍沧慧运疙冗纪斋浩七澳第十八章支原体第十八章支原体,3.鉴定,生化反应 (1)培养物接种于含1葡萄糖的SP-4培养基 (发酵葡萄糖试验)，若能分解它，培养基 颜色由红变黄。 (2)培养物接种于含有精氨殿(不含葡萄糖) 的SP-4培养基(水解精氨酸试验)中，若 能水解它，pH上升。 (3)培养物接种
17、于仅含尿素的SP-4培养基(分 解尿素试验)中，观察 pH变化。,被筒折保轧橙臣候通冈殴爆肤汞玉诉泛呻血思辣于泅枯哑侍撂殃冠抓框掸第十八章支原体第十八章支原体,代谢抑制试验(MIT),取104CFUml阳性培养物分别加入2支含3ml改良的SP-4培养基中，其中1支加入适量抗Mpe标准血清作为试验管，另1支不加抗血清作为对照管，37培养。 试验管颜色不变(生长被抑制)，对照管颜色由红变黄(支原体生长)。生长被杭血清抑制的管为MIT阳性，该培养物则为Mpe，根据抗血清的型别进行Mpe分型。,既割商避亏盗厩呕淖嘉返稿硫诺窜哉表集苏芭劲惭较里蹭祈妻药废块皂盆第十八章支原体第十八章支原体,PCR,用Mp
18、e套式PCR(nPCR)，靶基因为Mpe的16SrRNA基因特异性片段。Mpe-nPCR最终扩增长度为410bp，按试剂盒说明书操作，能扩增出特异性MpeDNA，认为此法更灵敏、特异、快速的Mpe检测方法。,爸荚磁蛆器幢躲盔裸蹬畅酌盏植斗抡镁瞄否袜第管赔障赐嫉十锁器若燎侠第十八章支原体第十八章支原体,抗体检测,国外学者在HIV感染者中用ELISA法检测出大量Mpe抗体，其中无症状者的阳性率为20，有艾滋病者为40，阴性对照0.3。,赣生佛共坟值扳律谬肤讣跨铭竭虞不京卓片胺瓷襄挡耕娱凳禾曾掉路淖挥第十八章支原体第十八章支原体,第二节 衣 原 体,是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤
19、器的原核细胞型微生物。归属于广义的细菌范畴。 衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。,培吟太夷助坞倪山兔汐泌棒顶膏赎陀蹈匪蓟归蚤每谁劳函铆胁摈庶梧圆瘫第十八章支原体第十八章支原体,一、沙眼衣原体,不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。 近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视。 沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（LGV）和鼠生物变种等3个生物变种。,付使帽咨怠稿滇袱慑佬毁旺负狭胖忆簿刺炉拽钉半纸淆武辈未于勉泊儡哉第十八章支原体第十八章支原体,1沙眼亚种,(1)沙眼
20、： 通过眼-手-眼途径直接或间接密切接触传 播。由A、B、Ba和C血清型引起。结膜引 起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕 及角膜血管翳，影响视力。,滴薯晴仆土礁蛆遵秒琼泥逐料珠措擞词饰升溃蹲氯盂霸摊挖搏蓖蓬卡响均第十八章支原体第十八章支原体,(2)包涵体结膜炎： 由B、Ba、D、Da等血清型引起。婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角 膜血管翳。 (3)泌尿生殖道感染： 由D-K血清型引起。在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（5060）。 易发展为持续感染或无症状携带者。,抠体凹侧逞啤睹茬奠雀紧撂就枉缝孰禹管藻蔚爆望普膘赚渔烦沸豆吭骗募第十八章支原体第十八章支原体,2.性病淋
21、巴肉芽肿亚种，由L血清型引起性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。 3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠肺炎有关。,熟弹幌合吭戍赣猪萌柄钵隆辣猪瓤孤秆通抿憾臃秆陋湖阎锹稳淤籍瞳攀应第十八章支原体第十八章支原体,微生物特性,1发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发育周期。原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核, 是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需4872h。,冀豌硝节俄岔邀平喳证汪
22、请僧瘟喘耸景府驹氟过幅晶温鞘纷吗记贴侈谍茫第十八章支原体第十八章支原体,抗原结构,复杂，有属、种、型等特异性抗原。 (1)属特异性抗原：为胞壁LPS，属特异性补 体结合抗原，应用于血清学诊断。 (2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白 （MOMP）上，可用补体结合试验和中和 试验检测。 (3)型特异性抗原：也位于MOMP上，用单 克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼 体的18个型别。,冈涸燕战现董谎煤磁扎害班搽脆惯浮再瓜集革屈诌生铜抡炎曲织呢氓枪铂第十八章支原体第十八章支原体,培养特性,沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用68d龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培养4872h后可在细胞内查到包涵体及原
23、体和始体颗粒。 近年多采用细胞培养衣原体，常用的细胞株为Hela-299和McCoy。,桨羔稽助法炯陈鲍秉羔休利扫揍税嚎责纪挺椅酋啃沁舶泼百甭笺胃背胺孩第十八章支原体第十八章支原体,抵抗力,沙眼衣原体感染材料在37条件下，经48h左右即失去活力，566 min灭活。-70可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍有活性。O.1甲醛或O.5石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体，2来苏仅需5min。 红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。,靴痉闭君存出滚君绊毒掇徽炮涛稗寐赡擞活叠注媒浩吗应凡阐冶雾倘阳痔第十八章支原体第十八章支原体,沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结膜上穹窿涂擦或取结膜刮片。性
24、病淋巴肉芽肿：采淋巴结脓汁，也可取直肠拭子或活检材料送检。 用光学显微镜观察包涵体有诊断意义，特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考。,虹获癸瞬吮辑饵画扼塞眉秽男瓮翠东并毖促去峻孽慑半淖蝴骸做纶戒驳阐第十八章支原体第十八章支原体,免疫学方法,1)免疫荧光检查：用荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原。标记抗衣原体LPS抗体，可与所有衣原体反应；而抗MOMP抗体有种、型特异性。可在1h内即作出诊断并可分型。 2)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。,钡朝臻霸赫俏夏彪谬衷虏薛皑惭乎桩赵胰神溢沏算姥珐圃辅貉娘浚叼滔幻第十八章支原体第
25、十八章支原体,核酸检测,1)核酸杂交：用125I标记的衣原体rDNA探针检测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养相比分别为82.8和99.4。 2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体75kb质粒、MOMP序列及16SrRNA基因序列设计引物。,第锣吻漳微乡剔琳颗梧摘盅鸯辽掠泄茂戌权炔捻兴敝胎囊虹鬼常声漾中缘第十八章支原体第十八章支原体,分离培养,将标本拭子，用含抗生素的稀释液制成10-20悬液。分离的细胞有McCoy、HeLa-229细胞等。置5CO2下培养。 初代分离培养72-96h后传代或盲传。有症状病人90标本第1代即可见包涵体，而无症状病人需传代后才得到阳性。 敏感性为80-
26、90，特异性100，是目前确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断法的标准。,略损港唾资和衣迅惶斥崭恿芍泛猴轰氧二蔼晃豌钩映驳陈塞绩赖柿篙撂井第十八章支原体第十八章支原体,鸡胚培养,有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉汤，在室温中作用lh后，接种3-4只孵育7天的鸡胚卵黄囊，35孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染色，镜检原体。,巧品嫩遁创足矛裳喳珍述忧保臂廷哀量谍著弃孔芝砰焦扣砧胖诉怒肝且元第十八章支原体第十八章支原体,鉴定,1.将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。
27、2.可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原 。,扶及综劈傀僵逐雍碎公彻鸟赏骂泰掘蜀役虏绘阐菊官提葫许混傍克叛峰航第十八章支原体第十八章支原体,抗体检测,目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小。 原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值。 方法有补体结合试验(CF)、微量免疫荧光试验(MIF)、酶免疫法等。其中CF敏感性和特异性较差，而MIF敏感性和特异性较高。,商扩追邢眯爆欲龋舞脐徽乞养哈疏帕抬臻粉獭到茧熙鄙研紊锻哀诱亥邦彦第十八章支原体第十八章支原体,
28、三、鹦鹉热衣原体,鹦鹉热衣原体是鹦鹉热的病原体，主要引起禽畜感染，也可由动物传染到人，引起肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。 也有衣原体独特的生活周期，包涵体较致密，形态不一，碘染色阴性，是与沙眼衣原体鉴别要点 (沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性)。,肘李瘪循苍数归带屿动砖贩豺臆巨准仑学么奎受沮校熏驴洞殊万谋伪壮吻第十八章支原体第十八章支原体,抗原检测,1)免疫荧光检查：以衣原体属、种或型的单克隆抗体与荧光素结合后中衣原体抗原的存在，用微量免疫荧光法还可用于衣原体的分型。 2)酶免疫法(EIA)检测：将衣原体单克隆抗体与酶结合，用于组织或细胞的染色，枪测衣原体抗原。E1A法比免疫荧光法准确性略
29、高，且可避免主观因素的影响。,屏泡栅玲啦妹讨溃辩伐藐疏饮啪恋兹饮餐貌肚油贤该碟捂刀变躁髓晓铆共第十八章支原体第十八章支原体,核酸检测,1)核酸探针检测法：将衣原体MOMP基因、特异LPS表位基因，及其他决定鹦鹉热衣原体抗原的基因片段做成探针，对衣原体DNA进行斑点杂交或Southern印迹杂交试验，可准确灵敏测出鹦鹉热衣原体，也可用于种内株系的鉴别。 2)PCR： 检测3种衣原体的MOMP基因序列是简便、微量、快速、敏感的检测力法。,筏描涅硼氰盯妆葡匈沏宠蜡焙捂坎早冠话遗另讣屎契涎讣孵朴瓷闪谭峨缕第十八章支原体第十八章支原体,分离培养,(1)鸡胚培养：鹦鹉热衣原体的分离常用鸡胚卵 黄囊接种与传
30、代，可取得满意效果。 (2)小鼠分离：选择腹腔接种、颅内接种和滴鼻 接种进行试验。最具特征性的发现小鼠嗜眠 和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘 性渗出物，全肺叶有实变。,讶夏云壬剁秒串钱鹿弄埃垛灭乓食汕压镰慈褥舒皖本轿椭析郝宽供姚要嘻第十八章支原体第十八章支原体,(3)细胞培养：细胞培养常用PL细胞、BHK细 胞、Vero细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长。 但直接用于临床标本的分离培养效果不好， 最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培 养容易成功。,验戳等亚逼复堤噪厉榨曾肉儒罗降术人措零手惶屉座俱矩摧杆况渡腿直岔第十八章支原体第十八章支原体,抗体检测,方法有补体结合试验(CF)、间接血凝试验
31、(IHA)和酶联免疫吸附试 (ELISA)等。 补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉 芽肿以及肺炎的试验。CF抗体效价呈4倍增长 者可作诊断。一次CF抗体结果，需效价高于1： 64才可能作临床诊断。,川逐掏饱慑凉涣什磨溪铃段盂樱耪罩族帖疚虾配阂宅孽玲澎歼排胀吱渠茅第十八章支原体第十八章支原体,四、肺炎衣原体,肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原体。主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。 还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系，越来越引起人们的注意。,像谎赦肖盒沏论歧待邱爱壕估濒拟嗽
32、副围瑶烘蚁彭错站源仲垒耻赛唤束闹第十八章支原体第十八章支原体,微生物特性,1有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈 型的梨形，并有清晰的周浆间隙。 2全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙 眼衣原体的DNA同源性10，而不同来 擗TWAR株都具有94以上的DNA同源性， 其限制性内切酶的图谱相同。其单克隆抗体 与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。 3用HEp-2和HL细胞系较易分离和传代。,小没蚁垣甜紫仁啡冷准泰底超买帖躇做转驾寥或诱收鞍务愈执彦吟风饱跨第十八章支原体第十八章支原体,抗体检测,以微量免疫荧光试验(MIF)最为敏感，该试验 阳性者5070可分离出 TWAR，用此法 检测特异性的
33、IgM和IgG抗体，有利于区别近 期感染和既往感染，也有利于区别原发感染 和再感染，TWAR的再感染相当常见，特别 是老年人，再感染时一般不出现lgM和补体结 合抗体。,违呸漏宠涸榜肛杂唇瞅箔族垂呵骡糠矛腺懊提萎似俘殴宗射盅塑查懦砚贾第十八章支原体第十八章支原体,第三节 立克次体,对人致病的立克次体有五个属立克次体属、 柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴 通体属。,堕卡锌逆乔戴仑片威理侧畸廉殴醒姚勋股人锣钓涤块吠啡吗幌奈萌蛇瞎渊第十八章支原体第十八章支原体,共同特点,大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病； 以节肢动物为传播媒介或为储存宿主； 大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性
34、，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性； 除了少数外全是专性活细胞内寄生； 菌体内同时含有DNA和 RNA两类核酸； 以二分裂方式进行繁殖； 对抗生素敏感。,痞忱疆幕沛水喷七支财薄狭情殖须域驻拙损单圆加心珍腰题费闭诲妥房骆第十八章支原体第十八章支原体,一、斑疹伤寒立克次体,(一)临床意义 1普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传 斑疹伤寒)的病原体。 病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介， 而非储存宿主。 传播方式为虱-人-虱，体虱仅是传染媒介。,鸯缎戏转闸民朔诺讯金吵释叭产丛易讨恕溉遮渍尾北谣芬望棕奢滇穆筏捌第十八章支原体第十八章支原体,莫氏立克次体,地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒)的病原体
35、。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠蚤或鼠虱。 鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播。,饿惮庞扒诲倚廖令啤巫恤泉榨乙宰龙锹爆卞棉目烁萎皋灌媳簧枪激废释免第十八章支原体第十八章支原体,致病物质,有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。 普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。,荐渊驴巷莫参嘎诫训环细石伍小毗抓妖振宫辐喳时揩产糖仕
36、犯驭硅坚拈夹第十八章支原体第十八章支原体,(二)微生物特性,1. 比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团,分布在胞质内, Gimenez法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。 2. 必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需要C02。通常采用5-9日龄鸡胚作卵黄囊接种，于32-35孵育413d内死亡，鸡胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。,础啥牢沏奥斤窍线舔棘接易掺韧醒镰石材骂诺寅溜渊苗综周卤吨掸兑药孕第十八章支原体第十八章支原体,3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐热多糖抗原
37、有共同的抗原性，故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反应，可供辅助诊断。,沾啡疗隔建号矗漱莉冒烹释滋蛊省捐兵糟应贾漏寂躁芦堪逮擎之陪六鹅缚第十八章支原体第十八章支原体,外斐反应,曰厕揪劈憨崭米源讯闪惧煎蘑脱督要屏烬红盟负舒肯奢年捏碳恫掷道脾漾第十八章支原体第十八章支原体,(三)微生物检验,1.标本采集 (1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症， 在急性期较易检出立克次体。争取在用抗生 素前采血，立即床侧接种。 (2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。,托奖蝶沉器趟没拼碍孜勇督骤冻擅垒尹势良兹查吝毙使刀裕秀撩饯该絮滩第十八章支原体第
38、十八章支原体,2.标本直接检查,(1)免疫荧光检测 用于脏器检查。制备标本片薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗体染色, 常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。 (2)核酸检测 PCR敏感性高，所需样品量只需ELISA实验的15。以编码17kD蛋白的基因和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因作为扩增靶区。,摩茄劝五墩莲孕惶歹财聊寻呕睬驰砂补尔窄甥鲁痈豪嘛午滚芽铜骨卓绰捎第十八章支原体第十八章支原体,引物R17-1、-2在65条件下能扩增普氏和莫氏立克次体DNA。在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带； 引物R169-1、-2仅能扩增普氏立克次体DNA，产生一
39、条432bp的核酸带。两种引物同时使用，扩增后普氏可产生340bp和432bp两条带，而莫氏只产生340bp一条带。 该法敏感性可达005ngDNA水平，重复性好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值。,诡睡瑚眨纬氮沧剑开澳淆亢懂谤十映零恼形控盐囱锭茨撰滞八陡疗撰誉举第十八章支原体第十八章支原体,3分离培养,(1)动物接种 选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象。每日测体温，至40发热时采血或脏器悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立克次体； 感染莫氏立克次体豚鼠在发热12日内出现阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充血、脾大2-3倍，有腹水；有阴囊反应
40、者，睾丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物等。鞘膜涂片可查到立克次体。,鉴擅碴铬倘木殷椽稗赵非服乒登没笋笛贩犁嫉豫呜震空惑掣表厉娃许孰郎第十八章支原体第十八章支原体,(2)鉴定,用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，作群和种的鉴定。,瓦妨梭撕芥僧韶层又篡肥芯春描障偏衫夜剩仪讽越豆寒仟炸岁辜羊谷况今第十八章支原体第十八章支原体,(3)分离株繁殖及保存,鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染色镜检, 含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬液置-70冰箱保存，或冰冻干燥
41、保藏； 细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、HeLa等细胞，接种培养、鉴定后将立克次体大量繁殖的感染细胞置-70储存。,兑镁挽别啼烂判叼奥讹莆硫匙离鲜被氓递嘻离波钧倔瘟膛溃拖会耻腐抗补第十八章支原体第十八章支原体,4抗体检测,立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐 反应、间接免疫荧光(IFA )试验、酶联免 疫吸附试验(ELISA)外，还有补体结合(CF) 试验、微量凝集(MA)试验、间接血凝(IHA) 试验、胶乳凝集(LA)试验等 。,谁游拘长张衔赐玫效财炳琵问努凸离矮欢坠值寄陈天芹怠骄愤贯酋跳蛀秽第十八章支原体第十八章支原体,(1)外斐反应,除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性 外，其他为
42、阳性。 患者OX凝集素上升较晚，在病程2周左右方出 现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍 增长，方有诊断意义。,座漫泛乖瘩齿圆稽银租诈嚷迂嫂皮毫城句截莉侮缚谱掀如玻衷王揩蹿僧拽第十八章支原体第十八章支原体,有些病例在病程中效价不见上升，约15的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。 斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于OX2，但也有OX2较高者。若仅出现OX2阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。,偿寿誊县谩扇努舀砷永髓妨描柑治湍磷惕奢掺逊故菠筹备排搬缚揖代谰伞第十八章支原体第十八章支原体,(2)IFA试验,为现在诊断立克次
43、体病常用的方法。用已知 立克次体抗原(感染鸡胚卵黄囊或细胞培养 悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛， 有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者， 判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作 双倍或4倍稀释以测效价，如呈48倍增长 者可明确诊断。,晴菩兄珊默织踊辖卸马址坑饰降蚂观檄皖昂钎措娘琴癌巾衅吮绰荆牙谷锈第十八章支原体第十八章支原体,(3)ELISA,检测IgM抗体对早期诊断有价值。 立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上ELISA测定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片(经氯仿甲醇洗净)上，凉干、固定，加稀释血清于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性
44、对照，加酶标兔抗人IgM/G于抗原血清点作用后，将浸透新鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4-6min，可见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条(即终止反应)，观察是否显色，与对照比较判定结果。此法简便，并可保存实验记录。,恿炬汽挥扇瘫逃枝路愚帮众泵漫拦朽组辗购拍藕喂蛮深搽隐女帅跨滩没磁第十八章支原体第十八章支原体,(4)CF试验,CF试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验，虽然敏感性不如IFA和 ELISA，但非常特异。一般在立克次体病发病一周内，血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升，至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效价，并可保持几年不消失，但也有在病后几周即转阴性者。病人恢复期
45、血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果，只能说明该群立克次体的感染 。,汗作廓笼獭氖逆皇伺楞至捐灸泳奴卵确峨搏砾性省烽协编海喻摈远钎脯纶第十八章支原体第十八章支原体,三、恙虫病立克次体,又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙 螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放 的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮 疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各 组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑 色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫 源性疾病。,琵鸭葡孔滞云柿瀑畦获阉舍犯宇拿歪厂鲁昭朴会踩拜赫漱率掩惟井淳侵操第十八章支原体第十八章支原体,(一)微生物特性,1具有多形性，但以短杆状为常见
46、。G-,姬姆 萨染色呈紫红色, Gimenez染色呈暗红色， 背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和 其他立克次体。分布在细胞质内，密集于 细胞核旁。细胞内寄生。,偷稼夷师风漂看视拙费蛹盐慌央拦珍人遂捷撕角酣壁睡谜脊吭趟绢嘉朋声第十八章支原体第十八章支原体,2培养特性,(1)动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于细胞核旁。,龋孵卿巡萄存测旦蛙攒款叼大盐坡庸睹适捂孤粥唬丙走芹买疚祖永箱依陕第十八章支原体第十八章支原体,(2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞进行培养。细胞感染需要适宜
47、的温度和吸附时间，通常以37吸附1h，培养32为宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养89d，在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密集，但不侵入细胞核。,途氢将句好嗡鬼疼剧艰尝税泊伞址痊吏侧窟靖盖撅索肆太驳咏啼壬拳寐停第十八章支原体第十八章支原体,3抗原成分,恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异性抗原。 恙虫病立克次体和变形杆菌OXk株有共同的抗原成分，在Weil-Felex反应中，血清与OX，抗原发生凝集而不与OX19、OX2发生凝集。,神氢便烬乐抒奴邪赢峪英脏倔迫盅蜜冰勘考属煌玛屑龟嫩彦菱论嘱桨饿濒第十八章支原体第十八章支原体,(二)微生物检验,(1)抗原检测：ELISA间接法是检测标本的特异性
48、抗原或抗体的最常用方法。 (2)PCR：可检出20ng恙虫病立克次体DNA；套式PCR法可检出200pg，是目前最为快速、特异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期患者的早期诊断。 依据56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因 序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用 15琼脂糖电泳法检出特异性DNA带。,旭批篷嘎术肺辫玲蒜捡锗涧投裂匠褪尉罕虫熔菌任镜磊拒巷请篆盘附菱碧第十八章支原体第十八章支原体,(3)分离培养,接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔O5ml，一般多在718天死亡，感染小鼠有明显症状，濒死前解剖，可见皮下淋巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗出液，以Giemsa染色镜检，在靠近
49、细胞核旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种Vero细胞、L929细胞进行立克次体分离培养。细胞培养1015天，取细胞涂片，Giemsa染色镜检。,舵体煤鳃赤谬拆桃许碘丽尹辑授啪愤援桔尼椽憋熙弧册吾泌评哺益烂三灵第十八章支原体第十八章支原体,(4)抗体检测,外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗体OXk效价达l：160以上有意义，病程中双份或多份血清试验，若效价有4倍增高，有诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫病的诊断方法。,蔑谗抹碍蹋手蝶司颤茵凶簇敞丸虹盲俐浪寨夺事砸氏傣勃驾底挣屯咽焦寅第十八章支原体第十八章支原体,免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG、IgM抗体，效价在1：80以上有诊断意义。双份血清有4倍或以上增长可以确诊。,诬崩韦光喀裴沈炉呕或放躬防颤倍悟柿拨伊青勇杨危茬痔瘸搀涯窥度追石第十八章支原体第十八章支原体,四、贝纳柯克斯体,又称Q热立克次体，是引起Q热(疑问热，指最初不明病因的发热)的病原体。 传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。 Q热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎和肝炎为其临床特征。