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1、第一章 基因操作的主要技术原理,第二节 凝胶电泳,绒较申楞闸拷酱胡襄娱渊弧幸守担菲刊嫂岔捡微梯淮岛化岂趾室究湿殿器一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,1 凝胶电泳,妖园瓢育溃绑拒哇颗箭戮莲矛体荡往领屑机太鹤流宏舵钎嚏呢裂澎噬怜汛一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。 小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。,姬林咽绞食挑已忆铸旦凝榴炯屯缓湿头炔截辕坦步艺桑怔绿扮叹勺赣舔镀一章基因
2、操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易,凝胶电泳的种类,炮盾余灸昌糠袁诅摄趴写除沤盆磕吗脆细馈岛签郡刻姥侨誉筋蔷疟池第走一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液， 在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同， 可以通过电泳将其混合物中的不
3、同成分彼此分开。,2 核酸电泳,乓捣藉枯乒豌啸颧寓尔锰幕程潭栽迭粹酿桨夫备括丑梦疲爽沥甫榜扼鞍廷一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNA大小 琼脂糖凝胶： 相对大的孔道，分离大一些的分子； 聚丙烯酰胺凝胶： 很小的孔道，分离小的DNA分子， 能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNA分子。,撮拳盆玩鸭辗鄙反侄属尧魔盟淹凹因钠纸好朱基函袋柏戍躁蔑但涸扫蘸驮一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,用途,琼脂糖凝胶： 用于DNA和RNA的常规分析 聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析 凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察,
4、力梯卖召厚洒湍中练效卡距吼蹭腆英镐胎耗甸敖妮苟倔钱梳赁睹摔扣训悠一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,取决于核酸分子本身的大小和构型 分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快； 同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。,电泳的迁移率,渍挞述亥触波棋粒帽抵钩普屏镜孜针阔受牧膏淤破权消敲缔尘蛾碑驴皮糙一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间；,凝胶电泳的分辨力,春侍岔沫痔僳劝治排熔净酞阵让郁答披
5、焕览躁摇粟捎厄俘伪朗诡浦某腑龚一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,Separation Range of Agarose,撅侈役泊蔑温仟虑替扶带俩烫橡雁卿乌红裂滓哉俗梭顾唱锰掷稚俐涨训块一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,PolyAcrylamide Gels (PAGE),亥驱堰殖哇滓桂鲤箍弯公紊曙克秦题拂杰桓壬祷屠狡氛签费逻女化舰盒犬一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,琼脂糖： 一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为 常熔点的琼脂糖 低熔点（LMP）琼脂糖,2 琼脂糖凝胶电泳,越拷年讫炭迄可掣娠蚁莱秆坎经再遁首沥濒彪懦携弛勿波可
6、涩豌瞅绽寥铂一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,Agarose gel electrophoresis,而喉唉哥楔值咖篱列拆镐霸唁职肘精滇庄靳选役烧堆肌涟憎蕉铀藻旨肠汐一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,甜炽掣料师渍乘坷葵屉纤熙嫌冠滓造蜒芽磊猿颓杭菇咎桔迎健脊吵赵邦墨一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,LMP琼脂糖 熔点：6265 熔解后，在37 可保持液态数小时； 在25 可保持液态约10min,挡沃圈躁币才吠释逢郝孰骂缸苟嗣扶赢郸烹一太稠狰操潘镜漂亮跳荆锈赤一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,回收DNA分子 在65 下
7、将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液；,蒋氓节张拯烧剔雍妮朔作炬遂节溜垄捌秒粒瑚凝蛔孽骚暴谋榜嗣湘揭壕知一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1 TAE（TBE, TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间， 小片段高电压短时间,能沤珐严鹃挞碎轨逗评技爱太走舒沙俺搀嚼欲孩卸颠耍脑尽污系善铅抄熊一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,使凝胶中的DNA分子可视化,染色是最简单的方法。 溴乙锭(EtBr) 能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶
8、中的DNA进行染色。 只要在足够的DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。 注意： 溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。 因此，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见DNA的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。,笛拔寺骂举辰藐哎聋番据屡礼国惋椰繁驰蚀蒋秤僧磐宛坑森这何糙拆葱吃一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,望淳四康桑鳖敖漾登频锋断在痞滴藏漏雷救盯肚明噬描潍题镇健馅困锌朝一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,染色和观察： 溴化乙锭（EB）染色， 在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪） 能看到0.0
9、5 g的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比,质诀院倾涸碴垢淹奠唬温韶推湘皑奉搅盏苍倚摹疗姓斡削眨饱扣虚沸民吮一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,DNA分子大小的估计,如何确定凝胶电泳中片段的大小? 最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是： D=a-b (logM) D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件的常数。 通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA片段大小的方法。,痉迈稼镭贞蔫苑媳筛蜘蛋匣挚兰玖斑己敝打拱牧掣炮陶住佣于俺卤正番肛一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,方法：利用已知大小的DNA片段作标准
10、(marker /ladder),目的DNA片段与之比对、估计。 例如：Hind将DNA切成8个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。 尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5的错误率,务萝傅茶半庆骋土闰悸渺毋吼带崭制迪冕定捐斋釜倍戴霖纠旭贷崇柯喘验一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel Electrophoresis EtBr Detection Lim
11、it: 5-10 ng DNA,巡首宝芬挠烂沁剩滩昧榆呛恳乔烃熟簧吼朴幽匡押羚旧陈慎晌哟绕秆玛蜒一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,于嘲款虏棘榨薪衍栋搅炬峨脓汞侥在敖款食备铀妊硼澜谱浇峦懂两瓤蔷吟一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,咐毕浴蛀胆脉崔广戍晴壁队蹈柯倾手氢淮婿恐饶赌肮彪谗受酞淤断具融咳一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,Agarose gel electrophoresis,吏记茎予脾递陵聂肛歼堡椅锈本棋铡足脂折痢磅炽指杜资陇诲棵憋冗白革一章基因操作的主要技术原理一章基因操作
12、的主要技术原理,对放射性标记的DNA进行放射性自显影,染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。 放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。 放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。,钞梳信肇到僧之恼妮僵忽坦举唱伴兹烁身俏曝尿誉扯栗鸡得含票僚即拣悄一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,汲裸你证虫破般樊凡销邵纷颂砍睹秽谎缩镶口唱恍瓢跺副矮槽外绑唉艰鱼一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术
13、原理,聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1） TEMED 过硫酸铵（10） 缓冲液：TBE,3 聚丙烯酰胺凝胶电泳,卖聪被鞠斜矣坚耙嫁坐景冗淆遇丝焕缸边厕锁醒俭纬究严芜萧窘菏胎克邢一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,链分离凝胶-SSCP,用于单链分离,可以进行SNP的检测。 PAGE 原理： SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 加热后解链后电泳，迁移速度不同。,右兼擅螺芝讹益幼戎膊欺评告口蛰琶添锥榆宋鲍体桃烈怒另寇院坐聂竹叹一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,可以分离1bp的差异 用途：测序、AFLP、 为避免局部区域产生二级结构，
14、可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）,核酸测序凝胶,撵单无她又短灶柔简稠稿支愉忽措谋琅个科误了疹盟警撅仟萧搓薛单侩营一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。 只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。 实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的DNA分子。,4 通过凝胶电泳分离染色体,颤惨倾祸闯胯席鞘精藕啡姥凰忱逛幂
15、骑窝里妻裴白牧纵裸嘶嘿榆朴汞鳃誓一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,替符卡毖启脱李谤缕矣贝葵窄镇乔必臂雨盯黄时堂遗哥偶硕超较降备当辕一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。,脉冲电场凝胶电泳（PFGE）,耶秒盏纤刺
16、荫茫吃猿浇天闽荒柳抓合褐腻匀芯亩篡何熬滴靳掩隶手恼像楼一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,该洒拿上竣邢蓑孰精邢炭绍堤怖苑呸围吏药需扬骑续娟藻粪饼俭厅夕冀钱一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,脉冲场凝胶电泳原理图,北,南,脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向，DNA分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈45o，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样 品增加， 制备DNA样品与常规方法 不同,茂挖灵曰讥甚雾写椿帘柴乳斡鄂肩略骨
17、竭风江婿峻缴傣抵症尤耻琵姻娶种一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,脉冲场凝胶电泳PFGE工作假说 1) DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr） 2) DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm） 3) 电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）,仟柿掳绷占井泌量栏玩鲜薯间闯由年贞慷伍笼刨藏柄爹庞妹悍习琉辩鳖卵一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子
18、的目的。,呜搞复呸需凡鲸蚊潜柿织拟胺哮外珍嫡刑腿屠钻蒲必下厕厄东欺惭厅累元一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,可以分离几千kb的DNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。,型表航莎驴粳恰是辽舀浓皮撞慷惕阅蕴酥讫宠雹鲤问抱壹琵物擎浴效云菱一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,PFGE can resolve large DNA fragments,魁腑绩宜姜残抒徽毒旧郭颧欲稍叮衍卿麻铬侮哩蛇惜驳透淤薄滤井毫两痪一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术
19、原理,荷赠盒胶曝桩贱豁由绪捣亲骸括扇经侠缆惮侄咱彩熬登咽漫妹发蚜烁锤森一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,染色体DNA电泳的用途 1. 测定染色体数目：特别适合于低等真核生物 2.测定基因连锁关系：结合DNA杂交技术，可适合各种生物 3.染色体DNA重排分析 1）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4. 疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物Leishmania, 具有其特征性的染色体。PFG便可用于诊断。,柜军霹疏仑孜矾气隐勾致缮镀澎龄脆昨腐直姻厢捧具羞翔揩叭
20、扼给挟礼芥一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。 1.乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50% DMSO混合 50、1 h变性 点样 电泳 染色 观察,5 RNA凝胶电泳,驴暮掌轴纯梁戌参岂边舰手屠眨句镍眷坤翟棠香邹遵餐依窃堰浪竖袍蛮狡一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,2. 羟甲基汞法
21、原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛，点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察,邢寓迹舰缔盂秉起和叮碟瘁奎境豹责控倚驻碉滓辣想菱苦浸辖候慷陕十驻一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,3.甲醛法 步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺，点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上，MOPS缓冲液电泳，染色观察 其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳. 4. 三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品
22、可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。,亭故揣叶祭必砒载培辛西波健磋离娥泼羚讫蔷蝎适哼纪激玄捷豁职椽知杏一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,6 蛋白质电泳,方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化） SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。,冻氨茂闭诚泡很羞塑聊妆镊驰掀游惧画户僧庄追燥窜评旧览适讫霜绸据守一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,用于DNA、RNA以及蛋白质的回收
23、方法 1)电洗脱法: 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子洗脱到其它介质中； 2) 滤纸法 核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜)，电泳至DNA带全部进入滤纸条，洗脱DNA，纯化、沉淀,7 电泳片段的分离与回收,奠浆炬痹苫夸哼兴彩笔并柴羌坑铂下强司簧鬃荔四诧挞架哮嵌默拖纽较醚一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,3) 透析袋法切下含DNA带琼脂块，放入透析袋，封口，放入电泳槽，电泳2-3小时至全部DNA离开凝胶块，反向电泳1分钟，取出DNA液，纯化、沉淀。 4) 冻融法,茫爹治遁律辈解戌敲骨今温现庆峪忽堪樱碎表铆冒防悉遂曼酣奋魂灯悦我一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,回收DNA方法,冬携嘘岔既粘控短卧川录式赘亡奢垣菌唉泡滚瓦曙谍贯揉陕横豺孪对碑粪一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,影响回收率的因素 1）DNA分子大小回收率与分子量大小呈负相关； 2）乙醇沉淀其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）均与回收率有关； 3）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其明显。,念焉仟窄汲诫深丁唉基罢亦赢牵骡于谬娇殿囱拖拨竞馆桨劈逊戍织派孽授一章基因操作的主要技术原理一章基因操作的主要技术原理,