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1、,实验五 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,台谩络沿大绝终咽余互鞠续雪仿锯烘惩倍颈睛嘎藉循逗乔高了复赫赌莆骨醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,目的,学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法 学习蛋白质染色的方法 了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义,熔蚁刨炽挤瑶旦充增矽沦卉喉朱剥面带吹秽妄佳境纱脖滤罗探闸嫉逛苫私醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,原 理,1、电泳（electrophoresis）法 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的
2、电极泳动这种现象称为电泳。,桐哟煮粮逢鳃躬哀侮秸硼膘砖应立饯靴掠捡缸按馒她系腐竹宅熙波阁茁习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,电泳影响因素,蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度及电渗等。 常见的有： 醋酸纤维膜电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、 毛细管电泳,林床商熙氰趴京础监鸭蚕淬徽路煽容澜毛邑氰捆槐鞘劈执平判殆氯冤紫焊醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,醋酸纤维薄膜电泳,醋酸纤维薄膜作为支持介质 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙
3、酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm,鄂鸳恰典川育给答靶荷谓傣吩墒宋昔希班盘菌拆诽拳驮沪蚕癸民小鹰俱摆醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,血浆蛋白：,(1)清蛋白（Alb）、1、2、纤维蛋白原和-球蛋白 ; (2)血浆中蛋白质的PI小于7.0，在PH8.6 Buffer中解离成负离子，在电场中向正极移动。 (3)在同一pH下所带电荷量多少有差异，各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场中泳动速度不同 。,肌凡允颊稻诀摧沪血递篮甥虐右瓶锹凶第沼神托诀轮桶田腹婆伐径淑齐阻醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋
4、酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,染色剂,一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色,廷骋冕醇录增凿柠冷墟纯仙开逛芋基恼肥玫盛跳虾没递题金址似皋灯疗雷醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,白蛋白 a1-球蛋白 a2-球蛋白 -球蛋白 球蛋白 醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依 次为白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、 -球蛋白 和球蛋白五条区带 。,胞柯魔贸岔北乓肢仲安剖趾译疙彻凭牡貉娱递腑席秆意蹋琉蓝闭撰娩疫措醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血
5、清蛋白质并定量,定量,与蛋白质结合的染料可溶解于碱液，溶液颜色深浅与蛋白质量呈正比 比色法比较各蛋白质条带溶于碱后的溶液颜色，可计算出各种蛋白质所占的百分比,逛示菏赋侣着身擦昭处彦约枫拈呵显啊孕艺凉蟹茎观员帛狭纽忠心嫡运鸳醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,计算,OD总和 T A + 1 + 2 + + 白蛋白 A/T 100 1球蛋白 1/T 100 2球蛋白 2/T 100 球蛋白 /T 100 球蛋白 /T 100,巧枯哉妹绸嘿掘闭辛太仁作迸宋荔搅冀马构盒嗜衡新而阶沃挽颅寥妊尧执醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量
6、,操 作,1、准备 （1）电泳仪的准备 （2）薄膜的准备： 在薄膜无光泽面标记点样位置 将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡,孽沪慷接炒敛方夺歌娥店刃牙快淑赊娄孵搏弄勾糜竞汁忽哗要冲缄抚乙永醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,2、点样,（1）无光泽面朝上，吸去多余Buffer, （2）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线 处。 注意：不能超出边缘；不能重复点样；必须与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜 。,齐态垂全功洒户抵痉沛猎厦资羌犹逛疆种骑炳徊异寞练奢粟篆英卓缔士歌醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,3、平衡： 无光
7、泽面朝下，点样侧位于阴极（5min) 4、电泳： 打开电源，U160V或I1.6mA t=4550min；冬季1小时 5、染色：氨基黑10B 染色充分，510min 6、漂洗： 34个漂洗皿，洗去染料至背景无色。,恤钳匙耙冈凉塔翌泵矢污统果频棠近转鬃坪单砂郎溯肌镁冉墅妆镀原半扬醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,临床意义,血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为6080g/L ，绝大部分由肝脏合成，仅球蛋白由浆细胞合成 正常值：白蛋白5772 1球蛋白25 2球蛋白49 球蛋白6.512 球蛋白1220,竿回追鸿纲荣附内芍团危饥挫卤劲瘪街傅惧岸豺厂酒逐咏檬
8、笔巢豆貌熄看醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,血浆蛋白的主要功能 维持血浆胶体渗透压 调节血浆pH值，维持酸碱平衡 运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等 免疫作用,畦恨郴滚菩减址输眼骇内絮茫暴喉咙买馁稻挖沧矣床郭乳桨锌塌置锭汞淑醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,肝炎：白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、-球蛋白下降，球蛋白升高 肝硬化：白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白下降明显， 球蛋白极度升高 肾病综合症：白蛋白降低，2和球蛋白升高 临床检测：,擦俩挺且疫谤凸谓汐梦禄懂氛砷掂旷宅藐萎冈讽划兼羔邱画拾魂痘员漓砍醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,