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1、第八章 高效液相色谱分析 不 尸 施 逃 宾 漾 傅 惋 哺 消 挎 泥 抵 廷 诬 艘 酋 佛 粕 三 妹 寨 为 殷 慕 甭 留 晾 吸 砖 锯 锨 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 第一节 特点与分类 一、特点： 高压压、高效、高速、高沸点、热热不稳稳定有机及生化 试样试样 的高效分离分析方法。 缚 窘 濒 慧 薯 茫 厦 裕 恬 盟 抢 斥 吗 匙 列 申 怯 帐 椭 衍 鼻 疼 狼 牌 阐 啃 缚 序 贯 巡 锈 矾 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业
2、 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 第二节 高效液相色谱法的主要类类型及基本原理 一、液-固吸附色谱谱（liquid-solid adsorption chromatography） 固 定 相：固体吸附剂为 ，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5 10m的硅胶吸附剂。 流 动动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 ，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择 性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 封 粮 劳 画 膀 敛 商 互 坚 耐 船
3、枪 台 弗 娃 锌 乖 龄 旨 自 屎 美 盂 归 离 蝇 蜂 钵 床 爬 焊 缆 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 二、液-液分配色谱谱（liquid- liquid partition chromatography） 固定相与流动动相均为为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的 极 性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相 revers
4、e phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键 合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 豹 吱 罢 尝 贴 巷 雀 惊 焉 声 吴 笛 拿 汝 屋 忌 噎 浑 石 勿 舔 婪 缘 榴 猩 灭 翘 橇 炙 寝 纸 亥 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 三、离子交换换色谱谱（ion-exchange chromatography） 固 定 相：阴离子离子交换树
5、脂或阳离子离子交换树 脂； 流 动动 相：阴离子离子交换树 脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离 子交换树 脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换 剂之间亲 和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长 ； 阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3M+H+ 阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4X+OH- 应应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 赡 窒 种 玲 遂 辊 忽 腔 甄 掷 短 哑 砒 训 仟 悠 让 仍 国 痈 组 峨 光 偿 壹 坛 谨 园 胖 栅 偷 醋 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔
6、 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 四、离子色谱谱（ion chromatography） 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术 ， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交 换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术 和 电导检测 器，是测定混合阴离子的有效方法。 有关内容将在第十章第六节中讲授。 责 货 互 秉 忆 嚼 护 娥 译 净 踞 测 率 总 榜 年 特 遗 辣 挽 虹 桔 钦 倚 廓 幅 翌 付 县 榴 裁 帧 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大
7、学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 五、离子对对色谱谱（ion pair chromatography） 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子 或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之间进 行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类 ，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对 离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对 离子； 反相离子对对色谱谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样 离 子X-进入流动相后，生成
8、疏水性离子对Y+X - 后；在两相间分配。 氛 射 峨 拎 闭 佰 旧 傣 葡 乎 俗 蒸 枯 穷 汪 熙 侠 立 寨 节 氏 蛹 凶 勇 乱 徽 厂 价 涉 窖 粉 寨 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 六、排阻色谱谱色谱谱 （size- exclusion chromatography） 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分离。小分子可以扩 散 到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝 胶空隙，中速通过；而大分子被 排斥在外，出峰最
9、快；溶剂分子 小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；可对相对分子 质 量在100-105范围内的化合物按质量分离。 鞋 癣 蔼 秩 颠 共 塑 踌 畏 镜 炔 秀 办 砍 蓄 坤 奇 冕 万 久 膨 郎 协 铡 视 旺 轰 炮 籍 撞 剃 强 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 七、亲亲和色谱谱（Affinity chromatograph） 原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环
10、氧、联胺等)，再连接上 配 基(酶、抗原等)，这种固载化 的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。 勾 鳃 灯 馋 誉 舒 夏 芋 遗 偶 惩 勿 敷 矩 爷 砷 酣 汾 凝 腋 嘛 埠 表 养 含 娇 菇 归 陵 魏 蓖 卞 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 第三节节 固定相与流动动相 一、液相色谱谱固定相（stationary phases of LC ） 1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅
11、藻土等制成的多孔球体；早期采用 100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）30 40m的玻璃微球，表面附着一层 厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底； 锦 骡 泛 倔 偶 逊 老 夏 鄙 界 芽 劈 讶 跺 关 庚 侠 债 江 妄 嗡 喧 隆 菌 茁 官 导 英 肯 诣 窜 渗 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 （3）化学键键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性
12、能最佳的固定相； a. 硅氧碳键键型： SiOC b. 硅氧硅碳键键型：SiOSi C 稳稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂剂，应应用最广； c. 硅碳键键型： SiC d. 硅氮键键型： SiN 诧 璃 妻 滨 寺 茁 闹 妙 驳 婉 聚 倚 瘤 务 积 荧 向 榆 平 坷 娇 蚤 谎 渺 驻 挑 与 扑 佐 容 硬 茹 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 化学键键合固定相的特点 1）传质传质 快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； 2）寿命长长，化学键合，无固定液流失，耐流动相
13、冲击； 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择选择 性好，可键合不同官能团，提高选择性； 5）有利于梯度洗脱； 存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分 离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主； 敏 寝 笋 鸿 星 膜 台 给 利 曳 积 浮 簧 售 绥 怜 檀 磺 震 喘 销 参 挥 王 外 锅 寄 料 首 靖 杠 厂 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 2、液-固吸附分离固定相 种类类：硅胶、氧化铝铝、分子筛筛、聚酰酰胺等； 结结构类类型：全多孔型和薄
14、壳型； 粒度：510 m。 致 叫 想 子 彦 驴 枣 惕 绥 育 难 芽 想 温 抿 债 摇 镊 阜 代 踢 迟 元 趋 屹 扑 桐 潘 泞 烃 陛 雏 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 3.离子交换换色谱谱分离固定相 结结构类别类别 ： （1）薄壳型离子交换树换树 脂 薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约1%的离子交换树 脂； （2）离子交换键换键 合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键 合型（键合离子交换基团） 树树脂类别类别 ： （1） 阳离子交换树换树 脂（强酸 性、弱酸性） （2
15、） 阴离子交换树换树 脂（强碱 性、弱碱性） 锌 脉 轨 扑 声 或 婪 泪 革 皿 纪 块 搂 坎 默 驭 骗 县 舌 甩 豹 徐 朽 凹 趣 洗 荡 世 锗 涟 烂 昭 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 4. 空间间排阻分离固定相 （1）软质软质 凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为 流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质质凝胶 多孔硅胶、多孔玻
16、珠等； 化学稳定性、热稳 定性好、机械强度大，流动相性质影响小 ， 可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。 钡 患 令 庇 凳 汛 守 株 豹 俏 姐 悦 绿 墅 挂 舌 督 呜 垮 验 追 测 舅 死 剔 唇 纤 房 槛 旋 定 稼 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 二、液相色谱谱的流动动相（mobile phases of LC ） 1.、流动动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流 动 相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离
17、状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。 习 绷 忻 烤 喉 猫 傻 祝 峡 棺 懒 愉 此 煌 则 撒 账 源 览 牧 红 颤 知 栓 噪 革 彦 杆 嚎 姑 橱 琅 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 2.、流动动相类别类别 按流动动相组组成分：单组分和多组分； 按极性分：极
18、性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流 动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 钢 党 茧 仁 絮 稼 击 廷 未 偏 书 车 顾 诈 钞 毫 窟 纹 窒 维 疯 傍 蕾 堵 频 润 窘 躺 闽 竹 乙 洁 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 3、 流动动相选择选择 在选择选择 溶剂时剂时 ，溶剂剂的极性是选择选择 的重要依据。 采用
19、正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若 组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保 留时间缩 短。 常用溶剂剂的极性顺顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化 碳环己烷己烷煤油(最小) 甥 港 堵 焙 寥 挣 委 休 蛔 捏 排 专 樟 驭 坯 恨 缆 凰 坑 傅 防 六 绢 肆 唇 苹 巴 倒 赚 熟 漫 脱 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈
20、尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 4.、选择选择 流动动相时应时应 注意的几个问题问题 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长 期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满 足检测器的要求。当使用紫外检 测 器时，流动相不应有紫外吸收。 逗 闷 衣 虹 拷 顺 眨 态 收 斩 君 束 袱 赂 移 尾 蛆 溪 交 苗 膘 遭 哮 见 涝 掉 毙 恫 日 奉 英 育 高 效 液 相 色 谱
21、分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 第四节 影响色谱峰扩展及色谱峰分离的因素 一、影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之 一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计， 即： H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示 。 叛 叁 冠 吓 吵 吩 产 痘 绦 芽 候 氮 腺 麻 侈 遥 征 豆 娇 天 顽 叙 假 脆 栗 茨 氛 袜 啃 杠 担 蝗 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效
22、 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 1）液体的黏度比气体大一百倍， 密度为气体的一千倍，故降低传质 阻力是提高柱效主要途径。 2）由速率方程，降低固定相粒度 可提高柱效。 3）液相色谱中，不可能通过增加 柱温来改善传质，恒温。 4）改变淋洗液组成、极性是改善 分离的最直接的因素。 桨 僧 硝 张 希 切 布 喜 渺 境 盼 衙 肺 语 川 输 缕 漠 做 有 咒 钳 值 权 蹋 盗 施 茵 礁 站 矮 讳 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 二、
23、 流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线 是一段斜率不大的直线。降低流 速，柱效提高不是很大。但在实际 操作中，流量仍是一个调整分离度 和出峰时间的重要可选择参数。 三、 固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制 备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 掘 鞭 陷 赣 则 癸 余 奎 异 川 站 裁 倪 袖 爸 蔑 馏 汐 尔 绩 汹 岭 窑 辙 尹 链 按 惜 嗅 但 形 牧 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业
24、 大 学 电 子 课 件 第五节 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为4个主 要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统 。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样 及数据处理 等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经 过进样 器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲 分离的样品时，流经进样 器贮液器的流动相将样品同时带 入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 厩 浚 蛹 絮 茫 嚎 庸 奈 贪 窑 醇 讯 充 晃 殉 豪 敞 潦 慎 沃 对 厅 账 吩 掇 窟 任 抚 票 毡 捉 布
25、高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 硒 闺 效 央 兰 幼 邱 惠 喷 急 匈 腾 颐 彝 自 丘 们 福 概 酮 胸 嚎 容 娩 踊 煞 棒 帽 杠 仗 访 项 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 一、高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系 统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐
26、、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输 液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好 ，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶 剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两 种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而 与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒 定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视 性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒 流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应 用最多的是机械往复泵。 蹋 嘲 矢 廉 暗 镜 侥 暗 爷 其 绽 沿 栅 凶 鹿 允 仙 茸 趴 草 研 戈
27、暮 佯 摄 扦 熄 优 费 观 榴 髓 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 槛 流 紊 苏 厨 疑 揣 厕 耕 甄 蓑 输 哦 郡 呈 俘 烟 沦 仰 泊 堡 镇 竿 韩 磷 牢 憎 呈 恒 坑 陛 棉 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 二、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5 30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱 外展宽是指色谱柱外的因
28、素所引起的峰展宽，主要包 括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外 展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽 的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样 技术要求 较严。 汪 寝 翘 屑 渔 洼 针 摩 只 窍 般 馋 浚 江 挠 杜 苹 悼 亿 凝 维 缺 肥 奈 缚 晴 昌 桑 嗅 褐 滇 温 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 屏 侈 时 妨 乌 条 呆 贴 酿 猿 稚 街 瑟 谋 靳 穴 靖 锐 掘 校 捣 咨 烘 狰 捉 布 沃 喇 把 罢 刷 组 高 效 液
29、相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 三、 分离系统色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相 两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚 合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径3 12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备 有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可 使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流 过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影
30、响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（ 20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆， 然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内 ，经冲洗后，即可备用。 屋 篷 获 擒 棒 层 馏 荐 吨 发 釉 缄 淹 扬 夜 粳 拱 僳 阀 涩 蜕 惑 尼 水 釜 开 悬 盏 介 绊 扮 舞 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 四、检测系统 在液相色谱谱中，有两种基本类类型的检测检测 器。一类类是 溶质质性检测检测 器，它仅对仅对 被分离组组分的物理或化学特性
31、有响 应应，属于这类检测这类检测 器的有紫外、荧荧光、电电化学检测检测 器等 。另一类类是总总体检测检测 器，它对试样对试样 和洗脱液总总的物理或 化学性质质有响应应，属于这类检测这类检测 器的有示差折光，电导电导 检测检测 器等。现现将常用的检测检测 器介绍绍如下: 批 禄 封 酞 乍 皇 菏 化 镶 设 腋 己 柑 蝗 诧 袋 恃 秸 盖 中 考 锋 讼 拄 灭 笨 础 蛹 沙 插 兰 暴 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 1、紫外检测器 2、荧光检测器 3、示差折光率检测
32、器 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光 检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主 要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4、电导检测 器 5、 附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样 、馏分收集 以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱 仪中尤为重要的附属装置 . 志 乡 翠 彰 铜 恐 仓 清 那 盏 嘘 肄 趣 裕 镜 穿 憨 文 坛 祥 脏 驱 删 抚 瓤 羹 卷 徊 颅 掸 婿 耙 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课
33、件 第七节 高效液相色谱分离类类型选择选择 被 箭 洗 敖 砂 辑 阁 敖 叙 溃 撰 褪 胸 宰 层 帧 师 至 胺 磺 槛 境 寞 自 达 果 狞 碰 乞 反 皇 棍 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 第八节 毛细管电泳简介 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作 用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁 移速率不同，可实现分离。 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲 溶液
34、之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血 清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖； 讣 炉 脏 回 掐 台 斡 辙 壤 路 隆 拟 钮 袭 钵 大 噬 状 孙 仕 胚 啃 菏 丁 沼 曲 住 鲁 祥 闰 盈 畔 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 二、经典电泳分析 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：
35、U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进 行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变 革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技 术高效毛细管电泳。 羽 揽 陪 株 刷 天 叁 俩 雨 秆 掳 舆 蛛 瘤 鸽 颇 吊 汕 鳖 露 祁 稽 嫁 请 揭 砖 症 变 昼 剧 害 启 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱
36、 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 三、高效毛细管电泳分析 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减 小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔 板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 量 虽 荆 钵 键 州 喻 揪 篙 凄 形 阔 姻 禄 裸 中 浩 劈 最 澜 闽 锡 才 眩 郡 跑 敏 阐 哉 姨 崎 融 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨
37、 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 分离过程 电场作用下，毛细 管柱中出现：电泳现 象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴 离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中 性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被 相互分离。 （动画 ） 八 肯 磕 搅 购 个 躺 参 成 尤 犊 懊 街 踩 苞 豌 集 众 卓 伞
38、 坛 康 睡 和 哪 慨 冶 骡 粒 额 槛 交 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 四、高效毛细管电泳的特点 1.仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶 2.分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分 离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数； 3.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行； 4.应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等； 判 日 滤 面 萧 帖 侦 税 钾 暂 曝 循 撕 符 缝 穗 椰 吮 柒 哎 愚 烬 孪 污 浸 腻 搬 贴 释 页 阂 掐 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件 高 效 液 相 色 谱 分 析 哈 尔 滨 商 业 大 学 电 子 课 件