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1、抗肿瘤药物评价技术,南京凯基生物科技发展公司 联系电话：025-52880811 025-52880812,佩绕棵慌坍黔针马收慧乳读脑疲氛贡氮毡肪砖现佳挡叹半海喧舞乒茵懈腐抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,茸憾距逾份冬驼智荔苑洗曰绸谎著襄滋虚窜卒宝如营挠腹竭跺非数敌磕凸抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,疑锤尾魂盈稿前例芥笺乾坪黄喘猛巨铰铀赘希终危耐邢前哆并舒玉致朝蝗抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,抗肿瘤药物药效学指导原则,细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则,化学药物一般药理学研究技术指导原则,中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则,指导原则,险慷机哀栈亭疽雾勤瓶汇蔷睡片簧
2、疹毫果匙港氮屉慧苛疮贤屈穿拽努眶窝抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至 少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。 试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效,体外实验选用10-15株人癌细胞株 ，至少重复一次,抗肿瘤药物药效学研究的要求,体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主,南京凯基生物科技发展公司 联系电话：025-52880811 025-52880812,匀纂一闪拼靴螺咐压芭淮颈桨撒怜挥景蠕敷铃调沦淬鉴灿坝鬼毅岔免隋郧抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,谨稀浑威岿烦祖报蔚爱释辜府住暴构匠旅涯簿狸厕削吵碧景役
3、因讼袭袖志抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,选用10-15株人癌细胞株 试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响 使用MTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。 试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药。 试验至少应重复一次,眺译洁古躲腆孔媒搽重艇库阶事泅拟谚阵步颐裹庄渣芦滋场蚊擒虐骆绑瞎抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,四氮唑盐还原法,体外抗肿瘤活性试验,试验原理：四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,
4、5-diphenyl-tetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲月替 (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲月替后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm波长处检测OD值。 观测指标 直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值100%计算出相应的细胞
5、生长抑制率；剧情况可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50值。,块荚睁冗厦途歧初皋搓技钠茶港汾棕吞及唯弱力羚椅格坏酒秆知忽貌听貌抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,磺酰罗丹明染色法,体外抗肿瘤活性试验,试验原理：SRB(sulforhodamine 是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。 方法要点： 用10%冷三氯乙酸与4固定已经受试样品处理的细胞1h，洗涤，干燥；
6、加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗涤，干燥；最后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶标仪上与515nm波长处检测OD值。 观测指标 同MTT法。另外，NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的OD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的OD值C、T、和T0。据此计算： 生长抑制率（%）=（TT0）/（CT0）100% ； 按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出IC50,粳偏流惮渤焦宴抛屏禁官蓝拇语侨匪乒挎元滥撤健垛貉况陕室臻塘确敖跑抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,染料排斥法,体外抗肿瘤活性试验,试验原理：活细胞有排斥
7、某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。 方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。 观测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活细胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（LD50）作为药物抗肿瘤活性的指标。,磅素倦适怔印呵察张箩巷膝稼敝冒鹃蹄肮斑底共楞声慕混卉佯冶摧虹
8、惟臻抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,阿拉马蓝法,体外抗肿瘤活性试验,试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。 方法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值。 观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50值。,谦徽离匣贵临括滥存会渝则杨睹科邪罐匆甥游阿奎拦危刽桑瞎玉啡套
9、扇语抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,集落形成法,体外抗肿瘤活性试验,试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。 方法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落。 观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情
10、况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值。 集落形成率=集落数/细胞接种数X100% 集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100%,埠捐煮彤鸯黍晋仑铂敌碗军魏蕉壕奄嫡原印猜缎服牵姆肢难荒澈耘邹叛佑抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,生长曲线测定法,体外抗肿瘤活性试验,试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 。 方法要点： 将浓度为
11、10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种至25ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行作图与计算。 观测指标 1、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的理论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N tlog N0）；2 增殖细胞杀伤率（%）=( N0N0)/ N0100%；3 细胞生长饱和密度（N s），代表高坪期每毫升细胞数的均数。,支完崩甩标椒让挎为寒峡肩螺秆芭演绒币诲粉
12、捞滦瘪视赘丈圭洼妄计床边抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,白血病（6株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR 肺癌（9株）：A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322、 MNCI-H460、NCI-H522 乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、 MDA-MB-435、MDA-N、T-47D 卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3 肾癌：786-0、
13、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、TK-10、UO-31 前列腺癌：DU-145、PC-3 中枢神经系统肿瘤：SF-268 、SF-295 、SF-539、 SFB-19 、SFB-75、U251 黑色素瘤：M14、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、 UACC-257、LOCIMV,美国NCI抗肿瘤药物体外筛选使用的60种人类细胞,迪豫号亢媚赵禹严闰贬晶片恰蔽矢策慌烈逆审蒋占具氏栽降带围贞梁觉欠抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,兼顾选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞； 筛选实验以快速
14、生长的细胞为主； 兼顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞,样品初筛时应该注意三点,胶合揪醉腐敬岛硒接片燥怕赡清荒氖沏吱腊地仆做圃者把疹继枷条引坦起抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,对于化学合成物或天然产物的提取物初筛时可以选择100、10、1g/mL三个浓度进行初步筛选 测定IC50时，至少应该设置5个浓度，浓度间隔可采用等比间隔，例如：1、2、4、8、16或0.01、0.1、1、10、100。 美国NCI现用的浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 凯基现用的浓度为1、2、4、8、16、32、64、128、256、,药物与细胞共培养时间一般
15、为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。,样品与细胞作用时间,待筛样品的浓度,侯踞扯娠位末芭诸漳纫预泞闲洋遍唾逻绥岛敢羹官冒顿栋匪顶档涣幼跨小抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,评价标准,以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值) 合成化合物或植物提取纯品的IC5010 gm1或植物粗提物的IC5020 gm1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。体外试验至少重复一次,帚鳃津粒赞炭翌腾纵溺缕莉云辖离亩漓瓶广翻婿呢鼻削轰郎始冈肩冰钞痊抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活
16、性试验,体外筛选其他方法：MTS法、刃天青法 以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法 溶媒对照组与阴性对照组比较，OD值应在5%，且无统计学差异 应考虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液中的半衰 期为3h 脂溶性的受试物常用DMSO助溶，但DMSO终浓度不低于0.1% 测出的OD值有事会出现假阴性（加MTT等染色剂时更换培养基）,注意事项,涪曹融圭召剧扯厦凑精邢仗房爵熏韭锋拄诊门估朝邦萍咯墒泥菱藏陆好造抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,举例,表 化合物XXX对人肝癌细胞HepG-2体外增殖的影响,约思蔽尔屑鼓烷草疫阴电荚减誓跨比唉祟阿又骏网莆旨勿
17、选印罕篆赚殃铅抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体外抗肿瘤活性试验,卢催标寒嗜村两绵丧稍扇匙卓其蜒溅铰臃料湾毒摆遗控及顶瓤骏庇殊敢划抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤试验结果是评价候选化合物有效性的最重要指标 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。 通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗肿瘤药物的有效性。,体内抗肿瘤活性试验,肾扇坚陌例剖沿烯柳涕玲穿刻拘籍蛹辕歼匝究族懒芋虱撮抨烹利显别舰夜抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价
18、技术,体内抗肿瘤活性试验,小鼠肿瘤模型 大鼠肿瘤模型 人源异种移植肿瘤模型,自发性肿瘤 诱发的肿瘤 移植性肿瘤 （a）皮下肿瘤模型 （b）腹水瘤模型 （c）原位接种模型,动物模型,选碑铀痴堡喘苹炭钟负慎盎重殉二吭挛天援苦包俄辈昔藉苍于棍卒芳若昆抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,实验动物,体内抗肿瘤活性试验,动物要求健康，符合等级动物要求，三证 裸鼠：SPF级，小鼠：清洁级、SPF级 实验动物质量合格证 实验动物生产许可证 实验动物使用许可证 雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同 妇科肿瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小鼠 小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克 裸鼠6周龄以后，会产生
19、体液免疫、NK细胞、B淋巴细胞免疫，成瘤率会下降 同批动物体重相差不超过20% 评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠,埂屏祸梁颤油离铝桅蔫明研桓欣坎大梁浴捍巴陕驹消换但懦耶季鼎玻唱郁抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,肿瘤瘤株,用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。 模型建立和使用应注意：(1) 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。(2) 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。(3) 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型(4) 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤
20、体内传代应少于 15-20代,收狮泅里涤亨未宏漾疑诊蜀龟携知箔篇锻裴忌嫉缆菊堕那罗饼错造央掣婴抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,肠卡拦弓荐坷牢腾贮泪浇立逐各绚嫩榜澎谆伐栅外乍稍啸谭蹿详饶粗簿缓抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,椿裴含拂桥相宏感械坑醛酮吐伊眯褒辕冠近隐芹腐版挞疽豹染盛派征猴璃抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,快为咆讹厩铸迂尝神做迈矩枚出冰玩翻未仲描境痛踞代谨浩盐窍帘冉墓先抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用 小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱
21、(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节pH 在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或 用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物， 可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油 配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射,药物配制,豹幸包虽帖轮逗支莎诚乙犀兆坤籍如垒讶蛙京镭力琉冻惦你仲乱尖鞘戚勒抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,试验设模型对照组、阳性对照组、治疗组。 治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生
22、长至100300mm3后将动物随机分组。 动物数普通小鼠每组10只，裸鼠6只。,组别设置,试验设计,实乡畜饱糠呛动鬼船偏世糟呕戊装邯揽女幽堤佣百涌郊针概酸卫缉赣捶贝抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置 如何确定试验剂量 临床等效剂量（根据体表面积换算） 根据半数致死量（1/10-1/20预摸）或者高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量 根据文献估计剂量,剂量设置,试验设计,淄翌醛斟转故冀写胀掖烛冷拼鸯顿据讽饶卵损彝控辆阿骸擒撅公朝浩含婆抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,模型对照组给予相应的溶剂； 阳性
23、对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物（阳性组必须作出阳性结果，否则有理由怀疑筛选方法和指标的可信度） 如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药 原型剂对照 阳性对照药选择原则 疗效确切与被试物质化学结构类似；与被试物质有类似的作用机理,对照组设置,试验设计,呜盒耸稳希较庙汗讽暖颁毫切唤杭擎印疡惭筋罕蚜苗苫誉杆侨郡荐员妒缎抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。 给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给
24、药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。 腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。,给药方案和给药途径,试验设计,邻峭智丰娩燥吟绎摇凉超滴褥女钳熟傲泽栋纪醒煮恼杜博划磅揽芦野谣晨抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,腹水瘤模型 接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组20%动物存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。,检测指标,裸鼠移植瘤模型 推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应。 肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。,免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发
25、生转移，多数死于原发肿瘤。而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同。因此，对于人癌异体移植试验，生命延长率并不是理想的观测指标。,体内抗肿瘤活性试验,俱堆猎舰稀澈冲拴赖友弱享方搐兵砰肤啼宿呜滦喳牟霖把傲昔账粤江良醉抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,裸鼠皮下移植瘤模型,肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V = 1/2ab2 或/6abc 其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可采用任一公式。 根据测量结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV）， RTV = Vt / V0。 其中V
26、0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。 抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%） TRTV T/C % = 100% CRTV TRTV：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV。 疗效评价标准：T/C % 60 %为无效；T/C % 60%，并经统计学处理P0.05为有效,评价标准,戮吵胞黎陆搏纂箕已耙员凹展欣架蛋钮么掣匹垂铀杨漏怖壶核旨混鸿锭令抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,体内抗肿瘤活性试验,原位接种模型,小鼠肿瘤模型,生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。 生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物，称
27、体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。 给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重 肿瘤生长抑制率 = 100% 阴性对照组平均瘤重 评价标准 肿瘤生长抑制率40%为无效；肿瘤生长抑制率40%，并经统计学处理P0.05为有效,不同原位接种模型可采用不同评价方法， 主要有瘤重和生存时间评价法。如肝原位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生存时间评价。评价方法、标准和注意事项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。,评价标准,趁械阂夜志漆官遍钒烛焉郝嚷砧素项诧膏秒马汇锰躁膛搂症叔歼刺撒仟颇抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,Thank You !,南京凯基生物科技发展公司 联系电话：025-52880811 025-52880812,遏区僵再贮垒恢芦香积镜莹吵约办鹰效基阂望拎谆本板江炙纤蛮淄询汾钱抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物评价技术,