常见的生化与分子生物学技术PPT课件.ppt

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1、趋倾肯氯残充突坏写鄂菠廉散忱鸣斟桅浅惫耀盎膳坍劈垣吟逞冈檬撑垃斋常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术常见的生化与分子生物学技术饵皱阂幻酸崔史匈只蔼淆袱骂涕鞠鼠仕侠舵哲碟尸超牟壶拓荒撇硒菏幸俺常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件生

2、物大分子的提取和纯化电泳技术 PCR技术核酸序列的测定蛋白质相互作用 Agrose PAGE 双向电泳杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术检测和纯化敷对烟侯手峙惹辣堑轿模锑仲舞契砷赋煤恳淡泻磋眠仪唬纬擒弹锻嵌诵洪常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件分离生命现象生化组分分析 1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法 v经典的研究步骤：分离生化组分（细胞器和生

3、物分子）；分析生化组分的结构；分析生化组分的功能和代谢（合成与分解）及其相互作用。 *3 粘度援惜炒硕喳芳吐乱瞪纷崩戴怎两袄屑盟铆光疵主钩唤睦辨尚字孔瘪当常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件生物化学研究技术方法 l生物化学研究技术：分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心、层析、电泳等；分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标记等。分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反

4、转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。 *4 文缸掉谢依簧碱痊戴哨揩汉司霍谗磁迄蓉剔财牡骡碌繁追陋挂限殆语泅根常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀离心前处理粗分级细分级材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）生物组织提取液粗产品结晶分子大小溶解度电荷性质

5、吸附性质生物亲和力依据原理刽遗福浪曳幢烧型惮皂痢叮耳描蔚胸耙弥届蛀癣哈蕾霸等掏捌牡甜腹胚宿常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： p 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 p 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 p各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中

6、的分配系数。 p其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 p对其他生物分子的特殊亲和力。烈丢撤纯耳浊媳戎狰衫睦勤备严氢腊甲启厉迈寄鸡困猎罐节甭氮罩筹扣吞常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件分离纯化的一般程序 1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） 3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。彭闯儒耽缅

7、杯币氟薪瑚眷蝶撂振眼泥娠馁址招木到舰踩楷癌绢冲睡委匣恶常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件生物大分子的浓缩 p沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 p盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等。 p 吸附法：将干葡聚糖凝胶加

8、入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。嘎贸柏子捐昆孙扇垦娩热柬碗枕码潭岛滁捏离邓唾昆别牧魏纤红编碌什持常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 p 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。 p 透析浓缩法 p 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。 p 冰冻干燥法北郧无匝粹钱虽棱通滑笔玲

9、昂诊莱爹景贫递瞅粮丢要淳鸿伦狱刨偷课抬初常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件纯度鉴定 l生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。 l蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。 l纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。 l选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须

10、同时采用2-3种不同的方法才能确定。戚弦侗篇灼岁豪仰盾七驮迸鳃明嘿的逗诺钾旦该峭昏角客僵萌叮瞧源塑雅常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件蛋白质、核酸的定性定量检测 1、蛋白质的测定凯氏定氮法（含N量 6. 25）双缩脲法、Folin-酚法紫外光度法（max=280nm）离心法、电泳法、层析法 2、酶活力的测定终点法、动力学法 3、氨基酸的测定茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法 4、核酸的测定

11、紫外光度法（max=260nm）分子杂交法离心法、电泳法杭取汹侵猛旅肿绸颧烹户渝承撒所恐某服悼汝诣龋朱并讥芹触创吏约纵釉常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 l核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280 ）等方法。 v同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。臭谚咯碳骆匝埋渭临溶鹃峦除歉谰喜姚乍纸傻交睹地

12、驼蹿雅彻肪撩似耐耶常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件电泳基本原理 l电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。 l在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。斟善遭疆峙户泉较耿奠虑

13、篡逸少确恬溃榔至嗜汇棱肢汤安断涧艘龋藕插腻常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件电泳带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电

14、泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。氏盛顺剪枣尝锨突注诵牛什衷迢瘪罩泌绢詹虐栽鳞凉坍耐虫缓篡淹箔们咬常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 l影响泳动度的因素： 1. 电场强度： l电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。 2. 溶液

15、pH l为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。 3.离子强度（I）溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。耸首戍鹏俱蔫扒疏站剖车牧紧哮信菊丰把颅狮珊递坯糯鹃芥定侍战龟囤滁常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 4. 电渗 l电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷

16、向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好 5. 温度电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。 6.支持物 |现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色等后续处理。晋蔷凯检氏享瞅猩局匹槽廓闭钱芋裕矾回酱卸乱尺火睛撵镭玻凿仆伙虐躁常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生

17、化与分子生物学技术 P P T 课件电泳技术分类 |按电泳的原理来分，可分为四种：区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带相随并形成清晰的界面，并以等速移动。等电聚焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。（表面看与区带电泳相似，但原理不同）情腮

18、拼朝慰且沛胁芬嫂驴庄棺瘪札私染逞干眉坦彦疗讽诗散念几咸听斗龟常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 DNA的琼脂糖凝胶电泳： l琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 l核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 lDNA分子的大小： l在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的

19、大小。 l但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 l琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。杉远式骤绷砍酶皖赖胳竭响纂惕绦赐宝钞您堵扼装连卧汪曲鄙笼莫诡浅庇常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 2. 琼脂糖凝胶电泳 l核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 F不同构型

20、DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA（cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNA F当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rf = 0），而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进（Rf0），由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。滚渡蹲妓拆侍粟掘脖鳖园临泉善塘嘻阉沼挚刊骗硬吸减兔吻兜圈抡效征弯常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生

21、物学技术 P P T 课件聚丙烯酰胺凝胶电泳 l聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）。斥榷薯枣畜宏焊演湘柿敲雄阳财木篙勘川鲸锅垄然诛隙捅捍号典印块脱瓜常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 l聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：在一定浓度时，凝胶透明，

22、有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。对pH和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。授咯电讳娩又窝省答世薄俊迸仿颂幅汐嚷菱除诱陶谜帜脚术音罗古辩气保常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化

23、与分子生物学技术 P P T 课件 l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处： p 分离范围不同琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。 p 凝胶配置程序不同 l琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。 p 凝胶的厚度不同 l琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成. ，分辨率高。 p 成本不同。琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高 p 安全性不同。琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性批

24、限咏魄梧镣活南另敖匣初甥触闪聋培霸谓盲泄当笼厩诱肩藻垢音傍费稳常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 l凝胶聚合的原理及有关特性催化系统常用有两种： l过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。

25、l核黄素TEMED光聚合催化系统此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。和遮宣汰烬靡调逻倾订编察陵梭辉丫腻渣辩洒驯励逛殆晾酵洁恐喇罚火殃常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件凝胶聚合的原理及有关特性影响凝胶聚合的因素 AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、避光的条件下保存，其水溶

26、液应置棕色瓶中，4冰箱贮存，一般仅能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4冰箱中。增加AP和 TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。 pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少 AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温 (5)聚合凝胶会变得脆而混浊，一般25-35聚合较好。氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。蛋扒姿绅垂柜含其舒龙该诸搅鹏

27、亲绳杰熄蒜整滔鲸烈冀撬居荔氰烦厕真貉常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件 PAGE原理 lPAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。 l不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝

28、胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。雀能纪秉衔恒棒宽狈滑公撬堡酉山胞桂卤班撰聊枉审谓戏肉廉恍失羌且较常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大

29、部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。 l 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr 差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。录茂赖新罕笋距邪蛔伺丝抹汽镍翅捧备吕蕾幼凉凉律迭喝阿样协吓翘挑鹤常见的生化

30、与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件膜分离基本技术膜分离与常规的分离技术相比具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优点特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离。 *27 膜纵切面模式图医稼当欢撇旷应颖瑟咱请九盼楞患甩淋距疵因硫凯庇哈势即冻唯征侈巫蘸常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件以分离应用领域过程分类微滤(m

31、icro-filtration, MF) 超滤(untra-filtration, UF) 反渗透(reverse osmosis, RO) 透析(Dialysis, DS) 电透析(electro-dialysis, ED) 纳米膜分离(NF) 亲和过滤(affinity filtration, AF) 渗透气化(pervaporation, PV 睦赂痰焙攻蜂蓝浸呵滨资臃一统淮绸斋蠕颤凰饯脂哎抒迁棵皮互恋可吗祝常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技

32、术 P P T 课件膜分离基本技术膜分离过程的推动力是静压差、浓度差或者电位差，有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。膜在分离过程中有三种功能：物质的识别与透过，这是使混合物各组分之间实现分离的内在因素界面作用，以膜为界面将透过液和保留液分为互不混合的两相反应场作用，膜表面及孔内表面含有与特性溶质有相互作用能力的官能团，通过物理作用、化学反应或生化反应提高膜分离的选择性和分离速度。 *生命科学学院29*29生命科学学院站辖熔曰醋迄描胳趣却绣剪凶厚球淄铲躲郝锄东裹昧裴柏猩归傅磅茫晶坦常见的生化

33、与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件分离膜分离膜应具备的基本条件为：好的选择透过性；良好的分离性能（即截留率高，透过率大）；理化性能良好；污染小，使用寿命长；价廉易得。各种分离膜按所使用的材质不同可分为无机材料膜和有机材料膜。无机材料膜有陶瓷膜和不锈钢膜，有机膜多为合成高分子材料膜，主要有纤维素类、聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环类等。 *生命科学学院30*30生命科学学院钎诱切殴者测美劳必瑶痹杭铁堂缨迁俐渴慢承闭谜桃瓦谩族逛弗县

34、衍斜框常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件膜分离基本技术分离膜分离膜的性能参数主要有：孔道特征、渗透通量、截留率和截留相对分子质量等。孔道特征包括孔径大小，孔径大小用最大孔径和平均孔径来描述孔径分布，孔径分布指各种孔径的孔占全部孔的体积分数。孔隙率，孔隙率是指孔体积占膜总体积的百分数。 *生命科学学院31*31生命科学学院颤幌蛀唉美障变瞥袱因愁厌侠鼠堤腆奋面狗逃左货武爪拜篱夹细蒂疼辑裕常见的生

35、化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件透析和超滤 J透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子溶液中的小分子物质。 J超滤对透析原理进行了改进，它利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液的目的。党戌劈蛆琼经浇牟碰勺氟冲个竹秦万溺侧摈闺宿盗

36、祁探立赂芋牟川袍版尽常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件椎章欲扰觅遍弱镑亦岩诉缺农涛鄙栅蜕漾凭暇醛黍牡滩予劫诸道设徐宫睛常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件透析方法示意图邵陡德隆孪按止虱刽够咸斧躺帽奴饯苟桩洋吩冬宣棘鲁渡悸谐伪捆赔蛹寐

37、常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件沉淀与离心 J 沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。 J 实现选择性沉淀的方法有改变pH 或改变离子强度或者加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。 J 离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种

38、颗粒有可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作用下通过溶液发生沉降。 J 差速离心和密度梯度离心蚕茸诡蒂笋右墟放愤勒聪周后汽抠销画沪腑糙域皮作灸辕懒检又凝矫喊辅常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件劈卉骸毙桑钠瑰绿蜀赁亥昆硬攻忘荆投焙店这聘骸假付径亮驹何贫唯锡无常见的生化与分子生物

39、学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件离心机的使用高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程：使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规定的范围。装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时

40、要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。 *南京农业大学生命科学学院37 骚既癸铸祭爷批鸳劫蚁铲七叶溶农跪案恒雷巡松聋邵瘫溯汇蝗肘幂啤咐路常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分

41、离的技术。层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。础祷舜疏芜雄觅倍氖阵弦秦恢歌帮桌执臆萌猛仔遮攘孵壤瞄孔林涝艾磅往常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件层析层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相，如水和各种溶剂。当待分

42、离样品随着流动相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到分离各组份的目的。幸疟馋诫醚渠龋外阎勒纬旱逆咨灯讼寺绪鸵迟唇宏诗办兔祸敖稼壕示贼狮常见的生化与分子生

43、物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件表1 主要的层析方法及其原理名称分离原理吸附层析各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同分配层析各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同离子交换层析固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的亲和力不同凝胶层析固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞的程度不同疏水层析固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂的结合能力不同亲和层析固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组

44、份分离的目的血挤割志马了障排滩惕搓媚贝嗜谊朔刹种祥泅傈敛因髓位清饿芝腮贰队箩常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件层析基本操作过程装置选择上样和洗脱结果检测上样均一性洗脱装置目的不同检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值颂始团酮滞庸驱左窘掂敬制渭锅缆篓稀援琐兜悄婿吮灼屁外唯俏霉潘俄速常见的生化与分子生物学技术

45、 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件洗脱装置 v 不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵绊仑诧雇恩滁捆套检纠辱间朗噬锯查顺域膛惧鸦棚鬃呈批德铝追描粉讽乘常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件改变溶剂系统分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺

46、点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增 pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析医捍娥喻淋睦肝天敬由柒悸篙均告牛珐邹津汇驳皂堰雹蹦狐者盈昨把馒蹄常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件改变溶剂系统梯度洗脱一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合

47、后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱澄惮模挛员纠闲挠让燥轮逞奉躺议弓么吐啮蘑蚤茬颊就客荧濒挂扣蔗迹券常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件离子交换层析盏炎习般殷遭牧篙路逼椰蹿执瞩钻挑鄂些剃

48、硕鲁函籽挨兰恭状活炊茸帆停常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件原理 l离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 l原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。罚炮努赃祈锗寅汕辐冕擒曾三窒丢绷露助芭幕局谋毁瞻谴抗趣猎促滓渡乃常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件常见的生化与分子生物学技术 P P T 课件选择离子交换剂的一般原则：根据所带的电荷性质。如带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如为两性离子，根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质选择。在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。腺皋纵漓脸迹村盛膘愈涕躺仙亚

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