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1、2D NMR 实验简介,前面已经介绍了绝大部分用于分析和理解脉冲序列的知识。接下来我们开始分析一些基本的1D脉冲序列。最简单的1D脉冲序列是用于采集常规1D谱的序列。 根据脉冲所在的坐标轴，我们分别用 90 x 或 90y 来表示外加射频场B1 的方向。 三角形表示FID信号的采样时段。,1D 脉冲序列,溶剂峰压制(Solvent Suppression),在核磁共振实验中，有时候溶剂的信号很强，ADC的资源基本上被用来描述溶剂峰而很少一部分用来描述实际的样品以致样品的信号被淹没在噪音中。,问题： - 动态范围; - 实际样品的信号低S/N; -实际样品的信号淹没在基线噪音中; - 接近水峰的
2、信号”骑”在水峰上. 解决方法：在采样前压制溶剂峰，常用的方法是预饱和。,预饱和(Presaturation),使用一长约定2-5s而低的脉冲选择的使溶剂峰达饱和状态，然后用一硬900脉冲激发样品。其结果是使接受器的增益参数增加而提高动态范围及S/N。,压水峰实验: 1. 脉冲序列 zgpr; 2. 预饱和时间为 2s; 3. O1移到水峰位置. 4. 逐渐的增加脉冲强度; 5.优化匀场条件,并准确调整O1位置.,下面的脉冲序列是反转恢复序列，主要用于T1时间的测量。 我们对 p 脉冲作用以后磁化矢量的变化做进一步分析： 信号将会在纵向驰豫（T1）的作用下衰减，我们可以看到不同的 tD将会如何
3、影响FID和FT后的信号。,反转恢复,对于不同 tD 延迟，我们所得到的信号强度会发生改变，改变的速度与它的 T1 驰豫时间有关。,反转恢复,自旋回波的脉冲序列如下： 我们分析 90y 脉冲后磁化矢量的变化：,自旋回波,前面我们已经介绍了单脉冲和多脉冲的1D实验。基本的2D实验可以看作是重复一个多脉冲1D实验，同时同步系统的变化一个延迟时间 tD。一个最简单的例子就是变化采样前的等待时间。 这样我们就有了两个时间域，一个是与1D实验相同的采样时段。另一个是由变化的延迟时间 tD 所带来的。,2D NMR波谱,对于二维谱脉冲序列通常可以分为以下四个部分： 第一个对自旋体系的扰动（脉冲）称为准备期
4、。 变化的延迟时间 tD 称为演化期， t1 称为演化时间。 第三格部分为混合期。在混合期中相关的NMR信息从一部分核自旋传递到另一部分核自旋上。 最后是检测期，这和1D实验检测期的概念相同。 t1 是变化的延迟时间， t2 是普通的采样时间。通过FT变化可以得到两个频率维 f1 和 f2。,2D NMR基础,最简单的2D脉冲序列就是COSY 序列： 我们讲分析一个偏共振的信号随 t1 变化的情况。从第一个 p / 2脉冲后开始：,一个基本的2D实验,第二个 p / 2 只会对 y 轴上的磁化矢量分量产生作用。 x 轴上的磁化矢量分量不受影响，但是 x 轴上磁化矢量分量的大小将受到它的频率的影
5、响。 A(t1) = Ao * cos(wo * t1 ),基本的2D实验,如果把所有的1D谱平行叠放起来，我们可以得到： 现在一个坐标轴已经是频率维（f2，来自于 t2），另一个坐标轴仍然是时间（t1）。 由于 t1 维信号强度的变化也是周期性的，我们可以得到一个类似于FID的信号。,基本的2D实验,FID的相位及振幅被t1调制也就等于谱图的相位及振幅被t1调制。从傅立叶转换中很容易看到这一点。,FT (t2),t2,t1,t1,f2,基本的2D实验,现在我们就有了 t1 维的FID，因此我们可以对 t1维的FID再进行第二次的FT变化（第一次FT变换是对 t2维），这样我们就可以得到一个二
6、维谱图。 我们在两个频率交汇处 得到一个信号峰。在此 信号峰位于对角线上。 为了分析谱图的方便，2D谱通常以等高线的方式显示。 不同等高线的颜色代表 不同的峰强度。,基本的2D实验,对t1进行第二次傅立叶转换就可以确定调制频率。就是将所有谱图的第一个点进行傅立叶转换，然后第二个点一直到所有的点。所得的谱图就是一个单位均为频率的两维谱图。,FT (t1),f2,f2,f1,t1,基本的2D实验,2D NMR 谱图常以轮廓图表示而不用三维的方式。相同情况同样使用在地图上。,基本的2D实验,等高线模式显示：,f2,f1,一个真正的2D谱图,2D NMR 术语,同核 2D NMR 实验谱图应为正方形矩
7、阵，1SW = 2SW (1TD 与 2TD 不用也相等),COSY,2D COSY (COrrelation SpectroscopY) 实验是最简单，也是最广泛应用的2D NMR实验之一。它是基于直接J偶合进行极化转移的同核化学位移相关实验。因此，通过分析2D谱图可以得到同核化学键相关的信息。,COSY实验主要有两种: COSY 45 的对角峰较小 COSY 90 的信号较强 COSY 60 介于以上两者之间,COSY (获得3J偶合关系),n-butyl acetate,1,2,3,4,5,6,1,6,5,4,3,4,3,5,DQF-COSY,多量子滤波 COSY (COSY-MQF)
8、实验是COSY实验的衍生物，多量子滤波可以压制低相干级数的信号。 DQF-COSY 实验可以有效的压制单量子相干的信号，如没有偶合的甲基、溶剂等信号。 DQF-COSY 实验的对角峰比普通COSY实验的对角峰窄，有利于观察对角线附件的交叉峰。但是它的灵敏度比普通COSY实验要低。,DQF-COSY,TQF-COSY COSY-DQF-PH COSY-DQF-PH-PR,NOESY,基本的 NOESY 实验序列与其它同核2D实验的原理相似。在90 1H 激发脉冲后，横向磁化矢量在 t1 时间内自由演化。下一个90 1H 脉冲建立纵向的磁化矢量，在 NOE 混合时间内，磁化矢量通过交叉驰豫或化学交
9、换进行转移。最后一个90 1H 脉冲重新建立最终被检测的横向磁化矢量。 NOESY 实验方法可以鉴别参与交叉驰豫的自旋以及测定交叉驰豫的速率。在 NOESY 实验中，交叉驰豫的主要原因是偶极偶合，因此参与交叉驰豫的自旋在空间上必定是相互接近的。NOESY 谱图中的交叉峰表明相应的质子在空间上是靠近的。这与 COSY 实验是不同的，COSY 实验通过 J-偶合建立自旋之间的相关关系。COSY 谱图中交叉峰表明质子之间在化学键上是接近的。,NOESY,NOESY 实验给出2D 同核化学位移相关谱，从谱图中可以得出质子间的空间相关信息。通常对角峰为正峰，化学交换交叉峰也为正峰，对于大分子来说，其运动
10、较慢，处于 spin-diffusion 范围，NOE 交叉峰为正峰（负的 NOE）；对于小分子来说，其运动较快，处于 extreme-narrowing 范围，NOE 交叉峰为负峰（正的 NOE）。因此，对于小分子来说，化学交换和NOE 交叉峰的相位相反，易于区别。,对于小分子，混合时间通常在 400-500 ms 左右，对于大分子，混合时间通常在 100-200 ms 左右。最佳的混合时间大小接近 T1 驰豫时间。,ROESY,ROESY (Rotating-frame Overhauser SpectroscoPY) 也可以给出分子的 NOE 相关信息。 在 ROESY 实验中，通过对磁
11、化矢量进行自旋锁定，使得交叉驰豫在旋转坐标系中进行。因此、横向的 NOE (ROE) 总是正的 (没有 NOESY 实验中 NOE 为零的情况)，同时化学交换的峰总是与 NOE 信号的相位相反。,在 ROESY 实验中，混合时间就等于自旋锁定的时间。在自旋锁定时间内，不同核之间发生自旋的交换,ROESY,在 ROESY 实验中，信号主要来自于交叉驰豫和化学交换。同时也存在有其它一些相干转移机制，产生干扰信号。 Signal type Phase Properties Observations Diagonal 正的同相位吸收峰 - ROE 负的同相位吸收峰 - Exchange 正的同相位吸收
12、峰 假的交叉峰 COSY 反相位吸收峰 假的扭曲的交叉峰 ZQC 混合模式的反相位峰 假的扭曲的交叉峰 TOCSY 正的同相位吸收峰 假的交叉峰,-ionone,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,11,9,8,7,12,1,9,8,NOESY (获得分子空间距离关系 5),NOESY (获得分子空间距离关系 5),C(11)上的H - C(9)上的H 2.5 C(11)上的H - C(8)上的H 3.8 C(11)上的H - C(7)上的H 4.7,TOCSY,2D TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) 实验可以用来指认整个自旋系统。
13、 TOCSY 实验可以用来获得分子中与其它自旋没有偶合的独立片断的特征谱图。例如：多糖中单个糖环的信号，蛋白质中单个氨基酸残基的信号。,TOCSY,TOCSY 实验中的自旋锁定通常使用 WALTZ、MLEV 或 DIPSI 的脉冲序列。自旋锁定时间（混合时间）决定了磁化矢量在自旋系统内传递的距离，对有机小分子通常设定为 80 ms 左右。,TOCSY (获得所有J-偶合关系),n-butyl acetate,1,2,3,4,5,6,1,6,5,4,3,3,J-Resolved 同核实验,2D J-resolved 实验可以在 2D 谱图的两维分别显示化学位移和偶合常数信息。 2D J-reso
14、lved 的脉冲序列就是同核自旋回波序列,反式检测实验,反式检测实验主要通过检测高灵敏度的核 (标记为 I，通常为 1H)，来研究灵敏度较低的核 (标记为 S，如 13C、15N)。 通常，最佳的实验方法如下图所示： 脉冲序列从激发 1H 磁化矢量开始，然后磁化矢量转移到低灵敏度的核上，最后磁化矢量转移回 1H 核上，进行信号的检测。,HMQC,最基本的 HMQC (Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation) 脉冲序列包含四个脉冲 1. 90 度 1H 脉冲建立横向磁化矢量，在 d2 时间内，横向磁化矢量在异核偶合作用下演化 2. 90 度 X 脉冲
15、建立异核多量子相干，在 2d0 时间内进行化学位移演化。 3. 180 度 1H 脉冲消除异核偶合和 1H 化学位移的演化。 4. 第二个 90 度 X 脉冲建立反相位的 1H 单量子相干，经过 d2 时间后，重聚为 同相位的单量子相干。 5. 在检测 1H 信号的同时，对 X 核进行去偶。,HMQC,HMQC 实验有不同的脉冲序列。,HSQC,基本的 2D HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation) 脉冲序列包含以下四个部分： 初始的 INEPT 序列通过 1J(XH) 使得极化从 1H 转移到 X。 在 t1 时间内，反相位的 13C 磁
16、化矢量在化学位移作用下演化。通过 1H 180 度脉冲重聚 t1 时间内 1H-X 间偶合的演化。 反向 INEPT 序列将极化从 X 转移回 1H。 检测 1H 的同时对 X 进行去偶。,HMQC (获得1JH-X之关系),n-butyl acetate,1,2,3,4,5,6,1,6,5,4,3,6,5,4,3,2,1,HSQC (获得1JH-X之关系),n-butyl acetate,1,2,3,4,5,6,1,6,5,4,3,6,5,4,3,1,2,HMBC,基本的 2D HMBC 脉冲序列与 HMQC 序列十分接近，只是加入了如下的改变： 在最初的 90 1H 脉冲后，可以加入 low-pass J-filter 压制单键的相关。 远程偶合演化的时间通常为 1/2*nJ(CH) (5-10 Hz)。 检测 1H 的同时对 X 进行去偶。,2D HMBC 谱图给出远程 1H-X 的相关信息。交叉峰通常表明 1H 与 X 核之间相隔两根键或三根键。 由于1J(CH)的作用，残留的单键偶合表现为裂分的两个信号。,HMBC,HMBC (获得nJH-X, n 2之关系),n-butyl acetate,1,2,3,4,5,6,1,6,5,4,3,6,5,4,3,1,2,