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1、.,一、生物学特性菌体形态及培养特征,革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。,.,大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌。,.,大多数菌株最适生长温度30-37，最适pH为7.0-7.5； 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。,.,所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。 金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，
2、大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。,.,生物学特性 致 病 性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶） e.肠毒素：引起急性胃肠炎。,.,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎
3、、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,.,葡萄球菌皮肤感染,.,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。,.,二、检验程序与操作方法,根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准： 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-94 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验,.,检样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水,国标：金黄色葡萄球菌检验程序,直接计数方法,
4、增菌培养方法,Baird-parker（贝尔德- 帕克） 0.3ml、0.3ml、0.4ml,75氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤,血平板,血平板 ，Baird-parker,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报 告,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 24hr,.,检验程序 增菌培养,利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5%氯化钠肉汤增菌。 置37摄氏度培养箱培养24小时。,.,检验程序 分离培养,血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。 典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明
5、，表面光滑，有溶血环。,.,大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环,.,血平板制作,成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。 制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。,.,BP（贝尔德- 帕克）平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素 丙酮酸钠是一种生长促进剂 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,检验程序分离培养,.,在BP平板上典型菌落
6、为：灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。,.,B-P平板,.,革兰氏阳性，球形，组成葡萄状,检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检,.,检验程序 鉴定之凝固酶试验,金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。 方法一：试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361恒温箱或水浴内，
7、每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。,.,试管法,.,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固，倒置不流动,.,有凝块,血浆,均匀混浊,生理盐水,方法二：玻片法 在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经1020s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果 。,.,兔血浆制备 成分：柠檬酸钠0.106 mol/L （31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中） 制法：一份加兔血9份混合后离心2000
8、rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。,.,葡萄糖肉浸液肉汤的制备,成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.47.6。 制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH，煮沸并过滤、分装，12130min高压灭菌。,.,25g样品+ 225ml 生理盐水,5mL样品匀液（1:10）+ 50mL胰酪胨大豆肉汤,血平板,36 1 24hr,镜 检 与 肉浸液肉汤培
9、养,血浆凝固酶 试验,报告结果,定性 检测,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 6hr,BP平板,.,25g样品+ 225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36 1 48hr,血平板、镜 检与 肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶试验,报告结果 金葡菌数/g(mL),定量 检测 （平板法）,每种类型选取一个菌落,36 1 24hr,36 1 6hr,适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品 计算办法：（三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加）血浆凝固酶阳性数5 稀释倍数,梯度稀释,.,第一天 器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种,.,第二天 接种选择性平板进行分离培养和玻片法血浆凝固酶试验,1、血平板制备及兔血浆制备 2、接种选择性平板 取增菌液1环，划线接种于血平板或BP平板。 3、培养 放于361培养24h。 4、玻片法血浆凝固酶试验,第三天 观察分离结果、镜检和葡萄糖肉浸液肉汤制备及接种,第四天 血浆凝固酶试验（试管法）、实验报告,