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1、实验一 抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。【实验原理】 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.00.l mm，外径8.00.l mm，高100. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经1
2、618小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来
3、计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。 （1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL） (式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL） (式 2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出： =Dantilog（IV/W） (式 2.10-3)式中：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之
4、比的对数，即log2或log4。 （3）求出Pr ：Pr = Ar (式 2.10-4)式中：Pr：供试品实际单位数；Ar：供试品标示量或估计单位。【实验材料和仪器】1.实验材料（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），菌液浓度约为106个/mL。菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。（2）抗生素标准品和供试品：头孢拉定标准品和供试品。（3）培养基：效价检定用培养基1号。（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0
5、.41g，加水1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液。制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121蒸气灭菌30 min备用。2. 实验仪器无菌室、培养皿（直径9 cm）、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台等。【实验步骤】1. 称量称量前，将抗生素标准品和供试品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前12小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20 mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好
6、，以免吸水。 称样量的计算：W=V*C/P (式 2.10-4) 式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg） V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL） C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，g/mL） P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，g/mg）2. 稀释从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 mL，稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液
7、。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，（预计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。3. 双碟制备在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20 mL），吸取已融化的培养基20 mL注入双碟内，作为培养基的底层，等凝固后更换干燥的陶瓦盖覆盖，放置2030 min，备用。取出试验用菌悬液，按已试验适当的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径1822 mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌
8、4850，芽孢可至60）的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口5mL吸管，吸取菌层培养基5 mL，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓦盖覆盖，放置2030 min，备用。4. 放置钢管用钢管放置器，或其他方法将钢管一致、平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置510 min，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。5. 滴加抗生素溶液每批供试品取510个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗23次。在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SHTHSLTL，也可用SLTLTHSH。（S代表标准品，T代表供
9、试品，H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入3537恒温培养室，培养至所需时间。6. 抑菌圈测量用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm。【结果与计算】根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。【注意事项】 1. 玻璃仪器和其他器具需用专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150160干热灭菌2小时或高压121蒸气灭菌30分钟，备用。2. 实验中样品的称量、
10、稀释、培养基倒平板等操作要严格的无菌操作。3. 制备平板时，放置培养皿的超净台的台面必须水平。可以将培养皿放在台面上，下垫一张白纸，皿内加水23 浅蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。4. 为保证双碟放置区域的平整，可在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。5. 在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基
11、表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。6. 在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。7.
12、 滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。8. 双碟在37下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。9. 在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。10. 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。 【思考题】1. 为什么要用两步稀释，而不直接从1000U/mL稀释到10、20U/mL？2. 生物效价测定实验室被抗生素粉尘污染会导致什么后果？