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1、1.2 FPLC使用指南From : USTC|Date : 2016-12-01简介（INTRODUCTION）FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography），其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。我们实验室有两套纯化仪，一台是AKTA prime plus（着重介绍），另外一台是AKTA pure protein(简单介绍）。AKTA Pure 纯化系统（详见AKTA Pure onsite-
2、training）AKTA Prime Plus 纯化系统 安全(Safety) 组件(Components) 方法编程(Method programming) 使用方法(Usage) 维护注意事项(Maintenance)安全(Safety)1.警告！系统必须与接地电源插座连接。2.警告！用户不能打开系统，因为系统含高压电路，会造成致命的电击。3.警告！必须总有上样环连接在上样阀的接口2和6。这是为了在转换此阀时防止液体从这些接口喷出。尤其是使用危险化学品时，这是特别危险的。4.警告！如果有大量溢出的液体渗入系统外壳并同带电部件接触的危险，应立即关闭系统并同指定的技术服务人员联系。5.警告！
3、NaOH有害健康，应避免泄漏。 组件（Components）AKTA prime plus蛋白质纯化系统包括下列部件：1.缓冲液阀和梯度转换阀(Buffer valve and gradient switch valve)： 缓冲液阀用于选择使用缓冲溶液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度转换阀用于建立梯度。2.系统泵(System pump)：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、梯度转换阀或经上样阀进入流动通道。3.压力传感器(Pressure sensor)：压力传感器可以测量在位液体压力。还可用作压力保护装置。4.混合器(Mixer)：混合器用于混合两元梯度。以两
4、步将溶液混合以得到最适宜的结果。混合器的体积可以选择。5.上样阀(Injection valve)：上样阀用于装加样环和用于将样品注射到柱上。6.检测器(Monitor)：检测器的目的是测量流出柱后液体的UV吸收、电导率和pH（任选）。用于这些测量的流动池安装在系统的右侧。7.具有分流阀的分部收集器(Fraction collector with flow diversion valve)：分部收集器用于将样品组分收集在管中供进一步分析。分流阀在废液和收集管之间转换流向。 方法编程（Method programming)主菜单概要Template该菜单出现在自检后启动时，用于运行予制的应用模板
5、和法模板。RunstoredMethod用于运行用户编辑的运行方法ManualRun用于不使用方法,手工运行系统。ProgramMethod用于编辑用户专用方法。SetParameters用于对检测紫外(UV)、电导、pH、温度、和运转泵及混合器设置参数。Check用于检测系统内部参数，例如序列号、泵运行时间、和灯亮度。使用方法（Usage)利用AKTA Prime Plus洗脱镍柱中的蛋白（以5 mL镍柱为例）1.打开AKTA（机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净分别插入到Ni-binding buffer和Elution buffer中，并在Template中选择system w
6、ash，洗泵(大概五分钟）。2.system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=1 ml/min。先将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样可以防止绿色线管扭曲），观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时End program。3.设定程序：流速3 ml/min，limit pressure为0.4 MPa设定breakpoint：0 ml：%B=4，set fraction size=020 ml：开始拉梯度，%B=4；开始收集样品，set fraction size 3 ml/tube80 ml：
7、%B=60；同时也一直在收集样品，set fraction size3 ml/tube100 ml：%B=60（有时有些蛋白量很大或者延时出来，可以设这个程序，以防万一），set fraction size 3 ml/tubeEnd4.蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净插入到蒸馏水中，并在Template中选择system wash，洗A、B泵。用蒸馏水清洗完毕后如果长期不用机器，需要用20%酒精再次清洗系统泵。并将收集器上的玻璃管收拾干净，并用水清洗，放于管架晾干。（总之，意思就是：0 ml时所有的系统全部要求置零，0-20 ml区间跑4
8、% elution buffer把杂蛋白洗下来。20-80 ml区间设定elution buffer的浓度从4%慢慢升到60%同时收集样品，80-100 ml区间用60%把剩余蛋白全部洗脱下来并收集样品，到达100 ml时停止。）5.蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面打开prime view evaluation软件，打来文件夹，在里面按照时间顺序找到你蛋白质纯化图谱，然后点击file，选择save as将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择export curves 选择01：UV和06：Conc并在Reduce number of samples中选择Red
9、uce by1。点击保存，得到excel表格，并用Graphpad prism5做蛋白纯化图谱。关键步骤：1.提前看好转盘与滴液体的部分是否靠紧，否则不会自动收集样品。2.根据出来的峰对应的离心管取下来放在冰上，取60 l至1.5 ml Ep管，暂放在冰上，用于制备SDS-PAGE样品。3.根据峰的位置选择样品，一般会有30 ml左右，加入1 mM EDTA和2 mM DTT以及PMSF，下面的gel filtration可以用super loop上样。4.万一电脑显示器上不更新图谱了，可能是与电脑的连接断了，需要关了纯化仪，重启。5.样品收集器偶尔会出现跳管子的情况，受样品是要注意从头或从尾
10、对一下管子。跑其他柱子也是一样。6.不要用蛮力摆动输送臂。松开固定输送臂按纽，并将臂升高。（如图示）7. 及时清理废液。（尤其过夜纯化蛋白时，要检查废液是否装满）利用AKTA Prime Plus过分子筛1.打开AKTA，将A泵用蒸馏水冲洗干净插入到gel filtration buffer中，并在Template中选择system wash，洗泵(大概五分钟）。并用gel filtration buffer手动或者程序设定清洗上样环。2.system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=2 ml/min(根据不同
11、分子筛设定流速）。先将AKTA上1号接线口湿接上部分子筛，此时观察柱子管道是否有气泡，如果有气泡那么应该将1号接口线湿接到分子筛尾部接口，待分子筛头部管道空气排清后再正过来接柱子，最后将柱子尾部接口接到探测器上。观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时End program。3.Super loop接上，6号出口线接super loop上面，下面出来接上2号口。4.设定程序（以30 ml样品和320 ml分子筛为例）：流速：2 ml/min，限压：0.4 MPa，A为gel filtration buffer，全程%B=0。0 ml：inject30 ml：load100 ml：load，set f
12、raction size=8 ml/tube（此处的break point体积以各自的蛋白大小而定）400 ml：load，set fraction size=0End5.蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵用蒸馏水冲洗干净插入到蒸馏水中,并在Template中选择system wash，洗泵。6.蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面打开prime view evaluation软件，打来文件夹，在里面按照时间顺序找到你蛋白质纯化图谱，然后点击file，选择save as将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择export curves
13、 选择01：UV和06：Conc并在Reduce number of samples中选择Reduce by1。点击保存，得到excel表格，并用Graphpad prism5做蛋白纯化图谱。关键步骤：1.super loop上尽量不要有气泡，如果有气泡只能跟过镍柱一样快跑完时手动调成load。所有参数在跑的过程中都可以改动，因此虽然程序上接样是从100 ml-400 ml这么宽的范围进行收集，但根据实际情况可以自己调。2.Super loop中的样品如果只有30毫升，在设定程序时需要有所保留设定为29毫升，以免分子筛里进入气泡。3.在使用绿色上样管时，请用注射器吸取少量gel filtrat
14、ion buffer，打入到绿色上样管中(一是为了去除气泡，而是为了去除管内液体）。 维护注意事项（Maintenance )1.每天，除了连续使用外，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存在装载缓冲液状态过夜。尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用System Wash Method完成以蒸馏水将系统彻底清洗，才予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将剩下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗。2.（我们机器没有pH探
15、测器）任何时间当不使用系统时，绝不要将pH电极留在流动池里。请不应将电极以水保存，否则这将使电极末端的玻璃膜，因长期保持于工作狀况下，会加速老化，甚或变干。电极可作以下处理：从流动池卸下pH电极。先以蒸馏水冲洗一遍，轻拭水份后，使其末端以其合适溶液泡浸保存。建议使用之保存溶液为：1摩尔KNO3及pH值为4溶液（以1：1）的混合缓冲液。3.若数天或更长的时间不使用系统，除用蒸馏水彻底清洗系统外。取下柱和pH电极（任选件）。通过细管道替换柱，并安装虚拟pH电极（如果使用）。然后用20%乙醇再冲洗所有使用的管件通道和所有的流动池一遍，然后并以此将系统保存。(pH电极应先行处理，参看上面2节的说明）。
16、UV流动池也可以如上所述地用蒸馏水冲洗然后用20%乙醇通过流动池。但如需要也可吹乾存放，重新放置上红的保护罩。在此并不建议使用压缩空气使之吹乾，因为其内可能含有油滴，造成污染。建议使用低压高纯氮气或憜性气体（如氩气等）。4.每月定期保养处理，或当发现假峰等问题出现时，可拆下柱子，并用适宜的毛细管道替换其位置，将所有的缓冲液入口管件置于1摩尔NaOH中，对所有的入口管件通路运行System Wash Method，以流速为每分钟1毫升，将整个系统充分冲洗若20分钟。然后立即用蒸馏水，以通条件将整个系统运行System Wash Method加以冲洗20分钟。5.当装配部分收集器出口管架时，应根据
17、收集管的长度不同而使用不同的切换口。调整时可将出口管和管夹放在输送臂上的长度导向小孔上，将管夹底在孔外臂上，将出口管轻推向下到达导向孔的底部，然后上紧管夹螺母。此可确保出口管露出正确的长度，以免造成跳管或收集体积错误情况发生。6.一定要保持实验环境的清洁，当使用仪器时发现缓冲液的泄露或看见机器各部件外表有盐的结晶应即刻用清水浸湿的抹布擦拭去除，以免泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1. 纯化蛋白前一定要检查废液缸是否装满，再进行实验，否则废液会溢出，损坏桌面和电脑等铁制物品，更严重的可能会导致漏电短路，造成不可挽回的损失。2.AKTA每个程序跑完一定要尽快把结果另存了，不然会很快被后面的一大堆数据淹没。每个人建自己文件夹。每个蛋白另建文件夹。3.事先做准备工作，比如准备柱子，预约机器，不然无法及时下班。（2016年 房康撰，曾威红校）