保加利亚乳杆菌的冷适应性与冷应激蛋白的研究.pdf

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1、保加利亚乳杆菌的冷适应性与冷应激蛋白的研究 雷雨婷,张英华,霍贵成* (乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学食品学院,哈尔滨1 5 0 0 3 0) 摘要:几乎所有单细胞生物在外界环境急剧降温的条件下都会发生应激反应,产生的一系列蛋白质被称为冷 应激蛋白。冷应激蛋白在乳酸菌适应低温环境和增强抗冻能力方面发挥着重要作用。本研究从冷应激蛋白着手,研 究了保加利亚乳杆菌低温适应性及冷应激蛋白的抗冻保护作用。在冷冻前进行2 0 预处理可以使保加利亚乳杆菌的 存活率增加1 0 0倍,而低于最低生长温度时,与对照组的存活率相差不大。通过S D S - P A G E电泳,冷处理样泳道出 现了两种7 k

2、u的冷应激蛋白。利用P C R技术进一步获得保加利亚乳杆菌中冷休克蛋白的基因片断,与L . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s A T C C1 1 8 4 2中C s p A序列同源性达到1 0 0 %。低温预处理可以增强菌体抗冻能力,且可以产生3条 6 . 3、6 . 7、7 . 0 k u的冷应激蛋白,初步推测低温诱导冷应激蛋白的表达抵御了冷冻对保加利亚乳杆菌的伤害。 关键词:保加利亚乳杆菌;抗冻特性;冷应激蛋白 中图分类号:Q 9 3 9 . 1 1 + 7;Q 5 1 1文献标识码:A 收稿日期:2 0 0 7

3、- 0 4 - 0 6 基金项目:国家 “8 6 3” 项目 (2 0 0 6 A A 1 0 Z 3 4 4) 作者简介:雷雨婷 (1 9 8 1 -),女,黑龙江人,硕士研究生,研 究方向为植物生物化学与分子生物学。E - m a i l : y t l e i 2 0 0 5 1 2 6 . c o m *通讯作者E - m a i l : g c h u o v i p . 0 4 5 1 . c o m 乳酸菌在食品工业中扮演着重要角色,作为 发酵剂参与多个发酵过程。作为从发酵乳中分离 出来的菌种-保加利亚乳杆菌 (现已更名为德氏乳杆 菌保加利亚亚种) (L . d e l b r

4、u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s), 有很强的产酸力,常用于酸奶、乳酸菌饮料、瑞 士干酪等发酵制品的发酵剂,因此对其发酵后冷 却及冷冻保藏过程中存活率的研究至关重要 1 。目 前,国内有很多机构和学者是从研究保护剂等外 部条件的保护作用的角度出发,而对乳酸菌自身 抵抗环境变化的保护机制研究较少。 微生物都能适应比其最佳生长温度低得多的 低温环境,已经确定在经过冷刺激的菌体培养基 里,有一种蛋白质优先表达,这种蛋白被称为冷 休克蛋白 2 。这些蛋白对细胞在低温时恢复生长和 发挥细胞各种功能是非常重要的。目前,对大肠 杆菌低温适应性的研究比较深

5、入,发现了1 4种低 温诱导蛋白,其中C s p A E C为主要的冷诱导蛋白, 低 温 条 件 下 大 量 表 达 , 它 一 般 绑 定s s R N A或 s s D N A,作为R N A分子伴侣 (R N Ac h a p e r o n e) 与细 胞中的m R N A结合,稳定m R N A,促进翻译 3 - 5 。 对乳酸菌冷诱导蛋白的作用及低温调节机制的研究 相对较少,但由于冷诱导蛋白对菌体抗冻特性的影 响,乳酸菌中C S P s的研究越来越受到关注。 为了提高L . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s的

6、冻干 存活率,我们可以以低温对基因表达的影响及低温 条件下的生理变化机制等方面作为突破口。本研究 主要从冷休克蛋白这一角度着手,探讨了冷处理对 菌体存活率的影响及冷休克蛋白与乳酸菌抗冻特性 的关系。为利用乳酸菌自身的抗冻机制来加以遗传 改造,提高乳酸菌冻干存活率以及工业应用提供一 定的理论基础。 1材料与方法 1 . 1材料 1 . 1 . 1菌种 保加利亚乳杆菌L 1 4由乳品工业微生物菌种保 藏中心 (K L D S - D I C C) 保藏。 1 . 1 . 2培养基 M R S培养基。 1 . 1 . 3主要试剂 溶菌酶、氯酶素 (S i g m a公司生产) ,D N T P s、

7、 T a q酶 (大连宝生物公司),S D S - P A G E电泳试剂 (S o l a r b i o公司 ) 。 第3 9卷 第5期东北农业大学学报3 9 ( 5 ) : 1 0 1 1 0 5 2 0 0 8年5月J o u r n a l o f N o r t h e a s t A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yM a y 2 0 0 8 文章编号1 0 0 5 - 9 3 6 9(2 0 0 8)0 5 - 0 1 0 1 - 0 5 1 . 1 . 4主要仪器 电泳仪 (D Y Y - 6 C) (北京六一仪器厂),9 7

8、 0 0 P C RS y s t e m(A B公司),超声波破碎仪 (J Y 9 2 - D) (浙江新芝 ) 。 1 . 2方法 1 . 2 . 1保加利亚乳杆菌在不同温度生长速度和温度 关系的A r r h e n i u s曲线的建立 测定选定的1株保加利亚乳杆菌在不同生长温 度条件下的生长曲线,试验选择的温度范围为7 5 0 ,根据试验室实际条件选取1 4个温度点,间 隔分别为4 或者3 。根据测定的生长曲线,选 择对数生长期测定的O D值,以l o g(O D) 对时间作 图,得到直线斜率为k,再分别计算l n(k) ,以l n (k) 对绝对温度的倒数 (1 / T) 作图 6

9、 - 7 。 1 . 2 . 2冷诱导对菌体抗冻特性的影响 保加利亚乳杆菌在4 2 培养,在O D值达到 0 . 7(对数中期) 时,取出,并对其进行冷处理。 冷处理方法:样品从4 2降至2 0分别保 持4h和2h;样品从4 2降至1 0分别保持4 h和2 h;以未经过冷处理的样品作为空白。冷处 理前1 0m i n每个样品取一半加入氯霉素 (终浓度 为5 0 !gm L - 1 ) 作为对照样。 对所有样品进行4次冻融刺激,方法是经过计 数后在厌氧条件下将样品放入冰箱中急剧降温到 - 2 0 、冷冻2 4 h,然后4 m i n、3 7 缓冻。分别 计数,计算其存活率。 1 . 2 . 3保

10、加利亚乳杆菌中冷应激蛋白的S D S - P A G E 电泳分析 取保加利亚乳杆菌接种至2 0 0 m L培养基中培 养至O D 6 0 0= 0 . 7时,分别取1 0 0 m L降温至1 0、2 0 继续培养4 h,离心收集菌体,用磷酸盐缓冲液清 洗3次,重悬,加0 . 1 g溶菌酶,通过超声波细胞 破壁仪破壁后,离心收集上清液。 将 上 述 样 品 及 未 处 理 的 蛋 白 对 照 样 进 行 S D S - P A G E电泳。参考L a e m m l i 8 方法进行,分离胶 浓度为1 6 . 5 %,夹层胶1 0 %,浓缩胶浓度为4 %,考 马斯亮蓝R - 2 5 0染色,采

11、用分子量范围3 . 3 1 3 2 0 1 k u的超低分子量标准蛋白质及多肽标准,分析保加 利亚乳杆菌中冷应激蛋白及其分子量。 1 . 2 . 4保加利亚乳杆菌中冷应激蛋白基因的P C R 扩增 根据全基因序列,合成引物P 1:5 - T T T G G T T A C T T T G G T T T G - 3 ;P 2:5 - G A C A T C T G G T G C T T T C C - 3。送至上海生工合成。 以染色体D N A为模板 (做空白对照),分别以 P 1、P 2为引物。反应程序:9 4 预变性4 m i n;进 入循环,9 4 预变性3 0 s,5 3 退火3 0

12、 s,7 2 延伸3 0 s,共3 5个循环;最后7 2 延伸1 0 m i n。 每次P C R反应均设空白对照。 2结果与分析 2 . 1保加利亚乳杆菌在不同温度生长速度和温度 关系的A r r h e n i u s曲线的建立 温度对保加利亚乳杆菌生长特性的影响见 图1。 如图1所示,同样出现3个拐点,分别为4 4、 3 1、1 7,这样曲线就分成4个部分,3 1 4 4 之间为最适生长温度,在这个温度区间内l n(k) 基 本稳定不变,说明在这个区间温度对微生物生长的 影响基本相同;在3 1 1 7 之间和小于1 7 时,l n (k) 随温度的降低而降低,前者l n(k) 与1 /

13、T成线性 关系,E 0不变,可以将1 7 确定为菌体的最低生 长温度。两个区间的l n(k) 随温度的降低幅度不同, 理论上都可以作为对保加利亚乳杆菌进行冷应激处 理的范围,但是因为这两个区间的斜率不同,也就 是温度因素对保加利亚乳杆菌生长影响程度不同, 这样的结果可能造成不同的冷应激反应。 2 . 2冷诱导对菌体抗冻特性的影响 保加利亚乳杆菌4循环的冻-溶试验结果见图2。 1 0 2东北农业大学学报第3 9卷 作为对照未经过冷诱导的保加利亚乳杆菌经 过4个连续的反复冻融试验后,存活率低于0 . 1。 经过2 0 低温处理后,保加利亚乳杆菌对反复的 冻融刺激的适应能力有很大提高,其中在2 0

14、保 持2 h的冷刺激对保加利亚乳杆的抗冻性的影响最 为显著,使其最后的存活率较对照组增加了1 0 0 倍以上,经过1 0低温处理,存活率增加不大 (分别为4倍和1 7倍)。加入氯霉素的样品存活率 接近或低于对照样。 2 . 3保加利亚乳杆菌中冷应激蛋白的S D S - P A G E 电泳分析 S D S -聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图3。 由图3可以发现,对于保加利亚乳杆菌,和 未经降温处理的对照样L - 1相比较,L - 2(降温至 1 0 ) 和L - 3(降温至2 0) 出现另外的3条新蛋 白质条带,分子量分别为6 . 3、6 . 7、7 . 0k u,初步 预测可能为几种主要的冷应激蛋

15、白 (C S P)。 2 . 4保加利亚乳杆菌中冷应激蛋白基因的P C R 扩增 结果见图4。 P C R扩增C S P s基因,P C R产物在1 . 0 %的琼 脂糖凝胶上电泳,E B染色后紫外灯下观察,有与 目的基因大小相符的条带,大小为5 0 0 b p左右。 测序结果表明克隆到T载体上的C S P s序列及 其推导的氨基酸序列与L . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a - r i c u s A T C C1 1 8 4 2中C s p A序列同源性达到1 0 0 %, 大小为5 0 0 b p。 雷雨婷等:保加利亚乳杆菌的冷适应

16、性与冷应激蛋白的研究第5期1 0 3 3讨论 冷刺激会对乳酸菌造成损伤,但低温预处理却 可以获得抗冻干特性。本研究首先通过A r r h e n i u s 曲线确定了不同温度生长速度和温度关系,理论上 出现了两个冷处理区间,本试验选取了1 0、2 0 两个冷处理温度。其次,在4循环的冻融试验中, 提前2 0预处理4h可以使存活率提高1 0 0倍。 而1 0 预处理时存活率增加不大。这说明低温预 处理可以使保加利亚乳杆菌获得一种抗冻特性, 加入氯霉素样品存活率接近或低于未处理样品, 可能是由于氯霉素抑制了某种蛋白的合成,这种 新合成的蛋白在低温条件下被诱导表达,保护细 胞,使菌体获得抗冻特性。

17、最后,通过S D S -聚 丙烯酰胺凝胶电泳发现3条7k u左右的冷应激蛋 白在低温条件下被诱导表达。这暗示了冷冻菌株 从冷处理过程获得的保护主要来自于冷应激蛋白。 P C R扩增获得的C s p A,编码序列:6 0 2 6 3 b p。与瑞士乳杆菌种C s p L同源性为5 0 . 7 %。与植 物乳杆菌中冷应激蛋白基因同源性为8 2 %。 低温预处理可以增强菌体抗冻能力,且可以 产生一些7k u的冷应激蛋白,初步推测低温诱 导冷应激蛋白的表达抵御了冷冻对保加利亚乳杆 菌的伤害,但是冷诱导条件与产生冷应激蛋白的 量以及不同冷诱导蛋白对保加利亚乳杆菌低温生 长及抗冻特性的影响还需要进一步的试

18、验研究。 4结论 a .通过A r r h e n i u s的建立,确定了对乳酸乳球 菌乳酸亚种K L D S 4 . 0 1 3冷处理的两个温度区间, 分别为3 1 1 7 之间和小于1 7 。 b . 1 0 保持4 h的冷处理,使菌体冻融存活率 较未处理的空白样增加了1 0 0倍以上,而加入氯霉 素的对照组存活率接近于或低于未处理的空白样。 初步推断可能是由于新合成的蛋白在低温条件下被 诱导表达,保护细胞,使菌体获得抗冻特性。 c .通过S D S - P A G E电泳,发现冷处理样有3 条分子量为6 . 3、6 . 7、7 . 0 k u的蛋白,初步确定为 冷应激蛋白。 参考文献

19、1郭本恒.酸奶-现代乳品加工技术丛书 M .北京:化学工业 出版社, 2 0 0 3 . 2 E r m o l e n k oDN , M a k h a t a d z eGI . B a c t e r i a l c o l d - s h o c kp r o t e i n s J . C e l l M o l L i f eS c i , 2 0 0 2 , 5 9 : 1 9 0 2 - 1 9 1 3 . 3 J o n e sPG , V a nB o g e l e m RA , N e i d h a r d tFC . I n d u c t i o no f p

20、r o t e i n s i nr e s p o n s et ol o wt e m p e r a t u r ei nE s c h e r i c h i ac o l i J . J B a c t e r i o l , 1 9 8 7 , 1 6 9 ( 5 ) : 2 0 9 2 - 2 0 9 5 . 4 J i a n gWe i n i n g , H o uY a n , I n o u y eM . C s p A , t h em a j o r c o l d s h o c k p r o t e i no f E s c h e r i c h i ac

21、o l i , i s a nR N Ac h a p e r o n e J . T h eA m e - r i c a nS o c i e t y f o r B i o c h e m i s t r y a n dM o l e c u l a r B i o l o g y , 1 9 9 7 , 2 7 2 ( 1 ) : 1 9 6 - 2 0 2 . 5 B r a n d i A , S p u r i o R , G u a l e r z i CO . M a s s i v e p r e s e n c e o f t h e E s c - h e r i c

22、h i ac o l im a j o r c o l d - s h o c kp r o t e i nC s p Au n d e r n o n - s t r e s s c o n d i t i o n s J . E M B OJ , 1 9 9 9 , 1 8 : 1 6 5 3 - 1 6 5 9 . 6 D e r z e l l e S , H a l l e t B , F e r a i nT , e t a l . I m p r o v e da d a p t a t i o nt o c o l d - s h o c k , s t a t i o n a

23、 r y - p h a s e , a n df r e e z i n gs t r e s s e si nL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u mo v e r p r o d u c i n g c o l d - s h o c kp r o t e i n s J . A E M , 2 0 0 3 , 6 9 ( 7 ) : 4 2 8 5 - 4 2 9 0 . 7刘云.对A r r h e n i u s中一些问题的讨论 J .内江师专学报, 1 9 9 7 , 1 2 ( 4 ) : 1 4 - 2 1 . 8 L a e m

24、 m l i UK . C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b - l y o f t h e h e a do f b a c t e r i o p h a g e T4 J . N a t u r e , 1 9 7 0 , 2 2 7 ( 7 ) : 6 8 0 - 6 8 5 . 1 0 4东北农业大学学报第3 9卷 S t u d yo nc o l ds h o c kp r o t e i n s a n dl o w - t e mp e r a

25、 t u r e r e s p o n s e o f L . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s L E I Y u t i n g,Z H A N GY i n g h u a,H U OG u i c h e n g (K e y L a b o r a t o r y o f D a i r y S c i e n c e , M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , C o l l e g e o f F o o dS c i e n c e , N o r t h e a

26、 s t A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , H a r b i n1 5 0 0 3 0 , C h i n a ) A b s t r a c t : N e a r l y a l l c e l l s r e s p o n d t o a d e c r e a s e i n t e m p e r a t u r e b y i n d u c i n g a s e t o f p r o t e i n s , c a l l e d c o l d s h o c k p r o t e i n s ( C S P

27、s ) . T h e s e p r o t e i n s a r e t h o u g h t t o p l a y a r o l e i n t h e p r o t e c t i o n o f c e l l s a g a i n s t d a m a g e c a u s e d b y f r e e z i n g . I nt h i s s t u d y , l o w - t e m p e r a t u r e a d a p t a t i o na n dc r y o p r o t e c t i o nw e r e s t u d i

28、e di nL . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s , w h i c h a c t i v e l y a d a p t e d t o f r e e z i n g d u r i n g a p r e t r e a t m e n t a t 2 0 , r e s u l t i n g i n a n a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 - f o l d i n c r e a s e d s u r v i v a l a f t e r f r e e z i n

29、g c o m p a r e dt o m i d - e x p o n e n t i a l - p h a s e c e l l s g r o w na t o p t i m a l t e m p e r a t u r e o f 4 2. N oa d a p t a t i o nw a s o b s e r v e dw h e nc e l l sw e r ee x p o s e dt oat e m p e r a t u r e ( 1 0) b e l o wt h em i n i m a l g r o w t ht e m p e r a t u

30、r eo f t h es t r a i n ( j u s t b e l o w1 7) . B yS D S - P A G E7k uc o l d - i n d u c e dp r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e d . T oc o n f i r mt h ep r e s e n c eo f c s p g e n ei nL . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s , P C Rs t r a t e g yw a su s e dt oy i e l dp

31、 r o d u c t so f d i f f e r e n t s i z e s . S e q u e n c e a n a l y s i sr e v e a l e dc s p - l i k es e q u e n c e sw e r eu pt o1 0 0 % i d e n t i c a lt ot h o s eo fC s p A o fL . d e l b r u e c k i is u b s p . b u l g a r i c u s A T C C1 1 8 4 2 . T h er e s u l t s h o w e dah i g

32、 h e r f r e e z es u r v i v a l c a p a c i t yo f L . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s a f t e r e x p o s u r e dt oal o wt e m p e r a t u r ea n dp r o t e i ns y n t h e s i s w a s r e q u i r e df o r t h i s a d a p t a t i o n , w h i c hw e r ef o u n di n t h e c l a s s o f 7k uC S P s . K e yw o r d s : L . d e l b r u e c k i i s u b s p . b u l g a r i c u s ; a n t i - f r e e z i n g p r o p e r t y ; c o l ds h o c kp r o t e i n s 雷雨婷等:保加利亚乳杆菌的冷适应性与冷应激蛋白的研究第5期1 0 5