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1、熊果酸对肝星状细胞NADPH 氧化酶-Hedgehog 信号通路的影响陈 璐1，何文华1，朱 萱1，李弼民1，张焜和2，施 凤1，张新华1 （330006 南昌，南昌大学第一附属医院消化内科1, 江西省消化疾病研究所2） 摘要 目的 探索熊果酸（ursolic acid，UA）对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的NADPH氧化酶（NOX）- Hedgehog（Hh）信号通路的影响。方法 将处于对数生长期的HSC-T6细胞分为6组：正常对照组；瘦素组（100ng/mL）；熊果酸自身对照组（50mol/L）；DPI自身对照组（20mol/L）；熊果酸干预组（瘦素+熊果酸）；DPI干预组（瘦素+DPI
2、）。在药物作用12h后，提取总RNA，采用RT-PCR法检测Shh、Smo、Gli1/2的表达；药物作用HSC-T6 细胞24h后，提取总蛋白，采用Western blot分别检测Rac1和Gli2的表达；药物作用12、24h及48h后，采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖情况。结果 (1)RT-PCR分析显示，瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Smo mRNA表达较正常对照组升高（P0.05）； 熊果酸干预后Shh、Smo和Gli2 mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（均P0.05）；DPI干预后Shh、Smo和Gli2 mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（均P0.05）；瘦素对HS
3、C-T6细胞Gli1 mRNA的表达无影响，而熊果酸及DPI干预也不影响HSC-T6细胞Gli1 mRNA的表达。(2)Western blot分析显示，瘦素刺激HSC-T6细胞24h后，Rac1和 Gli2蛋白的表达较正常对照组升高（P0.01）；熊果酸干预后Rac1和Gli2蛋白的表达明显低于瘦素组（P0.01）；DPI干预Rac1和Gli2蛋白的表达低于瘦素组（P0.01）。(3)熊果酸干预组、DPI干预组12h后细胞生长抑制率均显著高于瘦素组（均P 0.05 ) ; Pretreated with UA or DPI significantly down-regulate Shh, S
4、mo and Gli2 mRNA expression than the leptin group and normal control group( all P 0.05). Leptin, UA and DPI did not affect Gli1 mRNA expression. 2. Western blotting analysis showed that Rac1 and Gli2 protein expression increased when leptin stimulated HSC-T6 cells for 12h; Pretreated with UA or DPI
5、significantly down-regulate Rac1 and Gli2 protein expression (all P 0.01); 3. ursolic acid intervention group , DPI intervention group after 12h of cell growth inhibition was significantly higher than leptin group ( all P 0.01). With the prolonged duration of action , leptin inhibition rate further
6、decreased, while ursolic acid group , DPI group growth inhibition rate gradually increased. 3. The cell growth inhibition rate were significantly higher in UA intervention group and DPI intervention group than leptin group (all P 0.01). With the prolonged duration of action, their growth inhibition
7、rate were further increased.Conclusions UA can inhibit expression of Shh，Smo，Gli2 mRNA and down-regulate expression of Gli2 protein of hedgehog signal pathway in HSC-T6 induced by the leptin. The mechanism of UA inhibit HSC-T6 growth and proliferation may be that UA inhibited NOX subunit Rac1 protei
8、n expression then inhibit Hh signaling pathway. Key words ursolic acid; hepatic stellate cells; hedgehog signal pathway; NOX;Rac1 Supported by the National Natural Science Foundation (81260082) and Natural Science Foundation of Jiangxi Province（20122BAB205019）,Corresponding author: Zhu Xuan, Tel:86-
9、791-8692505,E-mail: 基金项目 国家自然基金（81260082）；江西省自然基金（20122BAB205019） 通信作者 朱 萱，电话,(0791)8692505,E-mail: 近年研究表明，Hh（hedgehog）信号通路参与肝纤维化的发生 1。死亡的肝细胞能够释放Hh配体2，激活的Hh信号通路能够促进静止的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化成为肌成纤维细胞（muscle into fibrous ，MFB）3-4。MFB自分泌或旁分泌的Hh配体使Hh信号通路持续激活的状态，促进HSC增殖、抑制凋亡5。Choi等6发现瘦素与ObR结
10、合后通过P13K/Akt途径激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MFB转化。NADPH氧化酶（NADPH oxidase, NOX）在肝纤维化发病中参与许多信号通路的调控 。最近有研究发现NOX参与对Hh信号通路的调控，NOX亚基 Rac1能激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MFB转化并抑制MFB的凋亡7。本课题组在前期研究发现，中药单体熊果酸（ursolic acid，UA）能下调HSC-T6中NOX亚基Rac1、p22PhoxmRNA表达及p47Phox的膜移位，抑制NOX活性而抑制ERK1/2信号通路、JAK2- STAT3信号通路活化，而减少I型胶原的产生并抑制HSC-T6细胞的增殖8-
11、10。本研究拟进一步观察熊果酸抑制NOX亚基Rac1表达后，是否影响Hh信号通路的激活。1 材料与方法1.1 材料与试剂DMEM （高糖）购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，重组大鼠瘦素购自美国PeproTech公司，熊果酸、DPI均购自Sigma-Aldrich公司，LY294002、SB203580购自碧云天生物技术研究所，Trizol、dNTP、Oligo(dT)15、Taq PCR MasterMix、DNA Marker I、2Taq PCR MasterMix购自北京天根生化科技有限公司，M-MLV Reverse Transcriptase购自美国Promega公
12、司，NOX亚基的引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；四唑盐(MTT) 购自普利来基因技术有限公司，Mouse Anti-actin Monoclonal Antibody、北京中杉金桥公司，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）购自美国Cell Signaling Technology公司，Anti-Rac1 antibody、Anti-Gli2 antibody、Anti-Cytochrome b245 Light Chain antibody购自英国abcam公司。1.2 细胞培养与分组HSC-T6细胞（大鼠肝星状细胞株）由上海中医药
13、大学肝病研究所提供。细胞用含10%胎牛血清、青霉素(120 g/mL)和链霉素 (100g/mL)的DMEM培养液，在37、5 CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞生长至80%90%密度时，分组传代至培养瓶继续培养。按加入药物不同，将细胞分为5组：正常对照组（给予含0.1二甲基亚砜的DMEM培养液）、瘦素刺激组(100 ng/mL)、熊果酸对照组（50mol/L）、DPI对照组（DPI 20mol/L）、熊果酸干预组（熊果酸50mol/L +瘦素）、DPI干预组（DPI 20mol/L +瘦素）。当细胞铺满孔底面积70%80%时，吸去原培养液，干预组加入含不同药物的培养液预处理30min，再加入
14、瘦素孵育12、24 h或48h；瘦素刺激组、熊果酸对照组和DPI对照组不经预处理，直接加入相应药物孵育。1.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Shh、Smo、Gli1/2mRNA的表达培养瓶中的各组细胞进行不同的药物处理12h后，按Trizol试剂说明书提取总RNA，并反转录成cDNA。大鼠型胶原和-actin引物序列采用Primer Premier 5.0软件设计（引物序列见表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应参数：预变性，95，5min；变性，94，30s；退火，Shh、Smo、Gli1/2和-actin的退火温度分别是：55、57、56和55，30s；延伸，72，1
15、min；终末延伸，72，7min；保存，4，10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析系统进行摄像和灰度值扫描并作相对量分析，将每组所测的型胶原mRNA灰度值，分别与相对应的-actin mRNA的灰度值相比较，计算出两者的灰度值比，实验重复6次。表 1 Shh、Gli1/2和-actin引物序列基因序列扩增长度 (bp)Shh正义链 ：5-CTGGCCAGATGTTTTCTGGT-3117反义链 ：5-TAAAGGGGTCAGCTTTTTGG-3Smo正义链：5GCCTGGTGCTTATTGTGG 375反义链：5GGTGGTTGCTCTTGATGG 3Gli1正义链 ：
16、AACTCCACAGGCACACAGG-379反义链：GCTCAGGCTTCTCCTCTCTC-3Gli2正义链 ：CCATTCATAAGCGGAGCAAG-3105反义链：CCAGGTCTTCCTTGAGATCG-3-actin正义链 ：5-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3432反义链：5-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-31.4 Western blot检测Rac1和 Gli2蛋白的表达药物作用HSC-T6 细胞24h，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。配制10%的分离胶和5%浓缩胶。蛋白样品加入SDS上样缓冲液，100变性5m
17、in。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜（NC膜），5的牛奶封闭2h，将NC膜放入一抗溶液中，4孵育过夜。Rac1抗体浓度11000，Gli2抗体浓度1800。洗膜后将NC膜置入二抗溶液中，孵育4h；再次洗膜后，采用化学发光液显影，用Molecular imager ChemiDocTM XRS分析系统进行曝光、摄像及灰度值扫描，将每组所测的Rac1、及Gli2的灰度值，分别与相对应的-actin的灰度值相比较，计算出两者的灰度值比。1.5 MTT法检测大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）细胞增殖待HSC-T6细胞生长融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化后，细胞计数并接种至96孔板内，细胞密
18、度约为每孔5000个，培养至细胞生长约占60%左右；按分组加药，每组另设6个复孔，分别培养12、24、48h；每孔加入无菌MTT溶液（5mg/mL）20L，继续放入培养箱中孵育4h后终止培养，每孔加入150L的二甲基亚砜（DMSO）振荡10min；在酶标仪上选择490nm波长检测各孔的吸光度（OD值）；细胞抑制率（%）（正常对照组OD值-实验组OD值）/正常对照组OD值100%。1.6 统计学处理实验数据以均数标准差表示，总体服从正态性分布，采用方差齐性行单因素方差分析（0ne way ANOVA）和SNK-q检验；如果不服从正态性分布或方差不齐，则采用秩和检验（包括Kruskal-Walli
19、s H和Nemenyi法），使用SPSS13.0软件进行分析。2 结果2.1 熊果酸对肝星状细胞Shh mRNA表达的影响RT-PCR果显示（图1），各组HSC-T6细胞Shh mRNA表达差异有统计学意义（F=3.41，P0.05）；熊果酸干预后Shh mRNA表达（1.090.46）明显低于瘦素组及正常对照组（P0.05）；DPI干预组Shh mRNA表达（0.800.43）也显著低于瘦素组及正常对照组（P0.05）。上述结果表明熊果酸和NOX抑制剂DPI均能下调HSC-T6细胞Shh mRNA的表达。a：P0.05,b：P0.01,与正常对照组比较， c：P0.05，与瘦素组比较；A：正
20、常对照组；B：瘦素组；C：熊果酸对照组；D： DPI对照组；E；熊果酸干预组；F：DPI干预组图 1 RT-PCT检测各组HSC-T6细胞Shh mRNA的表达2.2 熊果酸对肝星状细胞Smo mRNA表达的影响RT-PCT结果显示（图2），各组HSC-T6细胞Smo mRNA表达差异有统计学意义（F=7.116，P0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Smo mRNA表达较正常对照组升高（1.810.29）vs (1.390.33),P0.05；熊果酸干预组Smo mRNA表达(1.180.30)明显低于瘦素组及正常对照组（P0.01）；DPI干预组Smo mRNA表达（1.110.3
21、0）也显著低于瘦素组及正常对照组（P0.05）。熊果酸对照组、DPI对照组Smo mRNA表达均低于正常对照组（P0.05），与相应的干预组之间相比无统计学差异；上述结果表明熊果酸、DPI均能下调瘦素介导的HSC-T6细胞Smo mRNA的表达。a：P0.05，与正常对照组比较；b：P0.05），但各组的Gli2 mRNA表达差异有统计学意义（F=2.587，P0.05；熊果酸干预组和DPI干预组的Gli2 mRNA表达均显著低于瘦素组 分别为(1.040.31) vs (1.560.64)，(1.000.14) vs (1.560.64)，均P0.05）。上述结果表明，Gli1 mRNA表达
22、不受瘦素及药物干预的影响，但瘦素可诱导Gli2 mRNA表达上调，熊果酸和DPI可抑制瘦素引起的HSC-T6细胞Gli2 mRNA的表达。a：P0.01，与瘦素组比较；A：正常对照组；B：瘦素组；C：熊果酸对照组；D：DPI对照组；E：熊果酸干预组；F：DPI干预组图 3 RT-PCT检测各组 HSC-T6细胞Gli2 mRNA的表达2.4 熊果酸干预对瘦素诱导的NOX亚基Rac1蛋白的影响Western blot结果显示（图4），各组HSC-T6细胞的Rac1蛋白的表达差异有统计学意义（F值=45.29，P0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞24h后Rac1蛋白的表达较正常对照组升高（1.7
23、00.24）vs (1.000.00)，P0.01；熊果酸干预后Rac1蛋白的表达（0.510.06）显著低于瘦素组和正常对照组（P0.01）；DPI干预组Rac1蛋白的表达（0.530.21）也低于瘦素组（P0.05）。上述结果表明熊果酸、DPI均能抑制瘦素诱导的NOX亚基蛋白Rac1的表达。a：P0.01，与正常对照组比较；b：P0.01，与瘦素组比较图 4 Western blot检测各组 HSC-T6细胞NOX亚基Rac1蛋白的表达2.5 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞Gli2蛋白的影响Western blot结果显示（图5），各组HSC-T6细胞Gli2蛋白的表达差异有统计学意义
24、（F值=15.921，P0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞24h后，细胞内Gli2蛋白的表达较正常对照组升高（2.010.30）vs (1.000.00)，P0.01；熊果酸干预后Gli2蛋白的表达明显低于瘦素组（0.560.33）vs (2.010.30)， P0.01；DPI干预组Gli2蛋白的表达低于瘦素组（0.600.56）vs (2.010.30)，P0.05）。上述结果表明熊果酸和NOX抑制剂DPI均可以抑制瘦素诱导的Gli2蛋白的表达。a：P0.01，与正常对照组比较；b：P0.01，与瘦素组比较图 5 Western blot检测各组HSC-T6细胞Gli2蛋白的表达2.7
25、熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖的影响MTT分析所示（表2），各组处理12、24、48h后HSC-T6细胞生长抑制率的差异有统计学意义（F值分别为514.17、3080.50和4140.42，均P0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后细胞生长抑制率（-46.691.27）%显著低于正常对照组（P0.01），并随时间延长细胞生长抑制率进一步降低；熊果酸干预组、DPI干预组12h后细胞生长抑制率均显著高于瘦素组 分别为(-1.104.62)% vs (-46.691.27)%、(9.234.52%)vs(-46.691.27)%，均P0.05）。上述结果表明瘦素可以促进HSC-T6细胞
26、的增殖，并随着处理时间延长，其促增殖用增强。熊果酸及DPI可以完全抑制瘦素诱导的细胞增殖作用。表 2 MTT法检测各组12、24h及48h HSC-T6细胞的生长抑制率变化 (,n=3)时间组别各时间抑制率（100%）F值P值12h24h48h瘦素组-46.691.27-49.894.80-82.968.6883.8900.000熊果酸对照组42.727.8759.814.9377.723.55167.3170.000DPI对照组58.834.9474.593.6686.111.66249.5580.000熊果酸干预组-1.104.62-1.211.69-1.951.970.4120.664D
27、PI干预组9.234.526.532.543.452.4013.8340.0003 讨论近年来研究发现Hh信号通路也与肝脏损伤修复及肝纤维化的发生有密切关系1。当肝脏受损后, Hh配体Shh结合于跨膜受体Ptch,诱导它从原始纤毛上解离11,并解除对跨膜蛋白Smo的抑制，而Smo激活至细胞核内的Gli转录因子家族，从而调控基因的表达 12。因此Hh信号通路的激活与否，最终取决于锌指转录因子Gli表达情况。在脊椎动物中存在3种Gli的同源基因，分别是Gli1、Gli2及Gli3 13-14。本研究证明活化的肝星状细胞（HSC-T6）有Shh、Smo、Gli1/2 基因的表达。Choi等6发现瘦素
28、与ObR结合后通过P13K/Akt途径激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MFB转化。本研究中也以瘦素作为促进肝纤维化的因子，发现它可以上调Hh信号通路中Shh、Smo及Gli2的mRNA表达，但Gli1 mRNA表达却没有明显变化，推测瘦素激活Hh信号通路后Gli2是参与肝星状细胞增殖、参与肝纤维化的重要转录因子。NOX在肝纤维化发病中也起重要作用，De Minicis S等15研究发现瘦素通过JAK激活NOX产生ROS，以氧化还原方式活化AKT、ERK1/2等下游信号通路，引起SC增殖、纤维生成及炎症反应。新近研究报道NOX亚基Rac1可激活Hh信号通路，促进HSC由静止型向活化型转变7。本
29、研究通过Western blot检测发现瘦素可上调NOX亚基Rac1蛋白和Hh信号通路Gli2蛋白的表达，并且瘦素通过NOX激活Hh信号通路后，促进了肝星状细胞增殖。本课题组在前期研究发现，中药单体熊果酸能下调HSC-T6中NOX亚基Rac1、p22PhoxmRNA表达及p47Phox的膜移位，但熊果酸是否能抑制Rac1蛋白表达以及Hh信号通路的活化尚不清楚前期研究是否发表？。我们在瘦素作用HSC-T6细胞前给予熊果酸干预，发现熊果酸下调了Hh信号通路的Shh、Smo和Gli2的mRNA表达，说明熊果酸可抑制Hh信号通路主要分子的基因表达。进一步行Western blot检测显示，熊果酸显著抑
30、制了瘦素诱导的Rac1蛋白表达，并且下调Gli2蛋白表达，说明熊果酸能阻断瘦素诱导的NOX-Hh信号通路的激活。Hh信号通路激活会促进HSC的增殖 4,16，我们在前期研究显示熊果酸能够抑制HSC-T6细胞增殖，促进其凋亡17。本研究通过MTT检测进一步证实熊果酸能抑制HSC-T6细胞增殖，提示熊果酸抑制NOX-Hh信号通路是其抑制HSC-T6细胞增殖的机制之一。参考文献：1 Wynn,T.A.Celluar and molelcular mechanisms of fibrosisJ.J Pathol，2008 ，214(2)：199-210.2 Jung Y, Witek RP, Syn
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