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1、实验二,小鼠脾脏淋巴细胞的分离,小鼠脾脏淋巴细胞的分离,目的 原理 实验步骤 注意事项,目的,熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法,原 理,脾脏各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。,原 理,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,淋巴细胞,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,Ficoll：1.0770.001,(PBMC),1.092,1500rpm, 20 , 30min,PBMC,红细胞粒细胞,Ficoll,稀释外周血,Ficoll,稀释
2、的血浆、血小板,实验步骤,1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨（研磨同时滴加1640培养液，保持细胞活性） 2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取，沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层液上方（Ficoll：血细胞=1：1）,实验步骤,3.2000r/min，离心15min 4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移入另一试管中,实验步骤,5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min离心5min ，弃上清 6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数,注意事项,1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染,细胞计数,实验步骤 注意
3、事项,实验步骤,1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数,实验步骤,5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）104,注意事项,1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数,试验报告要求,原理, 步骤, 结果, 讨论。,