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1、实验九 多管发酵法测定水中大肠菌群 实验九 多管发酵法测定水中大肠菌群 一 目的要求一 目的要求 二 基本原理二 基本原理 三 实验材料三 实验材料 四 操作步骤四 操作步骤 五 实验报告五 实验报告 一 目的要求一 目的要求 1 学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法 2 了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性 保证水中不存在肠道传染病的病原菌保证水中不存在肠道传染病的病原菌 天然水体中的病原菌很可能是受粪便污染带入。天然水体中的病原菌很可能是受粪便污染带入。 只检测水中是否有肠道正常细菌存在，而不直接 检测水中的病原菌。 只检
2、测水中是否有肠道正常细菌存在，而不直接 检测水中的病原菌。 我国生活饮用水卫生标准我国生活饮用水卫生标准GB5749-85中关于生活饮 用水的细菌标准的具体规定如下： 中关于生活饮 用水的细菌标准的具体规定如下： 1 细菌总数细菌总数1ml水中不超过水中不超过100个。个。 2 大肠杆菌数大肠杆菌数1 L 水中不超过水中不超过3个。个。 3 若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠 菌群数平均每升不得超过 若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠 菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯 消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升 不得超过 个；经过净化处理及加氯
3、 消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升 不得超过10000个。个。 二 基本原理二 基本原理 多管发酵法包括三个部分多管发酵法包括三个部分 初发酵试验初发酵试验 平板分离平板分离 复发酵试验复发酵试验 1 初发酵实验1 初发酵实验 发酵管内装有发酵管内装有乳糖蛋白胨乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置液体培养基，并倒置杜氏小套管杜氏小套管。 乳糖乳糖能起能起选择选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群大肠菌群 能发酵乳糖而能发酵乳糖而产酸产气产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基 内加有 。为便于观察细菌的产酸情况，培养基 内加有溴甲酚紫溴甲酚紫
4、作为PH指示剂，细菌作为PH指示剂，细菌产酸产酸后，培养基即由原来 的 后，培养基即由原来 的紫色变为黄色紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的 作用。 。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的 作用。 水样接种于发酵管内，37下培养：水样接种于发酵管内，37下培养： （1）（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变 ，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果； 24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变 ，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果； （2）（2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应 视为可疑结果。 在量少的情况下，也可能延迟48h后
5、才产酸产气，此时应 视为可疑结果。 以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大 肠菌群。 以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大 肠菌群。 （3）（3）48h后仍不产气的为阴性结果。48h后仍不产气的为阴性结果。 2 平板分离2 平板分离 平板培养基使用平板培养基使用伊红伊红美蓝美蓝琼脂琼脂（eosin methylene blue agar，EMB agar）。伊红美蓝琼脂平板含有伊红 和美蓝染料，在此亦作为 （eosin methylene blue agar，EMB agar）。伊红美蓝琼脂平板含有伊红 和美蓝染料，在此亦作为指示剂指示剂，大肠菌群发酵乳糖造
6、成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌 群产生 ，大肠菌群发酵乳糖造 成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌 群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色） 阳性菌落 带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色） 阳性菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均 需在以上平板上划线分离菌落。 。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均 需在以上平板上划线分离菌落。 3 复发酵试验3 复发酵试验 以上大肠菌群以上大肠菌群阳性菌落阳性菌落，经涂片，经涂片革兰氏染 色 革兰氏染 色为革兰氏为革兰氏阴性阴性无芽孢杆菌者，无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。 通过此
7、试验再 进一步证实。 原理与初发酵试验相同原理与初发酵试验相同，经，经24h24h培养培养产酸 又产气 产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群的，最后确定为大肠菌群阳性阳性结果。结果。 大肠菌群 厌氧芽孢杆菌 好氧芽孢杆菌 大肠菌群 厌氧芽孢杆菌 好氧芽孢杆菌 初步 发酵 初步 发酵 产酸 产气 产酸 产气 水样 接种 水样 接种 大肠菌群 好氧芽孢杆菌 大肠菌群 好氧芽孢杆菌 大肠菌群 革兰氏阴性无芽孢 大肠菌群 革兰氏阴性无芽孢 革兰氏 染色 革兰氏 染色 产生 典型菌落 产生 典型菌落 鉴别培养基 平板分离 鉴别培养基 平板分离 产酸 产气 复发酵 产酸 产气 复发酵 阳性管阳性管 三 试验
8、材料三 试验材料 采集的水样：河水、池水、湖水等水源水采集的水样：河水、池水、湖水等水源水 培养基：培养基： 普通浓度乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）普通浓度乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管） 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小 套管） 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小 套管） 灭菌水灭菌水 伊红美蓝琼脂平板 伊红美蓝琼脂平板 四 操作步骤四 操作步骤 1 水样的采取水样的采取 2 池水、河水湖水等水源水的检测池水、河水湖水等水源水的检测 （1） 稀释水样：原水样） 稀释水样：原水样10-110-2 （2） 初步发酵试验） 初步发酵试验 接种水样接种水样 混匀后，37培养2
9、4h，24h未产气的继续培养至48h。混匀后，37培养24h，24h未产气的继续培养至48h。 水样稀释及接种水样稀释及接种 水源水水源水 10-110-2 1ml1ml 9ml 无 菌 水 无 菌 水 10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 1ml1ml1ml 3倍浓缩乳糖蛋白胨倍浓缩乳糖蛋白胨 5ml 50ml 10ml100ml （3）平板分离（3）平板分离 经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵 管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上， 再于37下培养24h，将符合下列特征的菌落的一小 部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 经24h培养后，将产酸产气及48
10、h产酸产气的发酵 管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上， 再于37下培养24h，将符合下列特征的菌落的一小 部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 深紫黑色、有金属光泽。深紫黑色、有金属光泽。 紫黑色、不带或略带金属光泽。紫黑色、不带或略带金属光泽。 淡紫红色、中心颜色较深。淡紫红色、中心颜色较深。 （4）复发酵试验（4）复发酵试验 经涂片、染色、镜检，如为经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢 杆菌 革兰氏阴性无芽孢 杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通 浓度的乳糖蛋白胨发酵管 普通 浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一 初发酵管的同类
11、型菌落1-3个，37培养24h，结果 若 中，每管可接种来自同一 初发酵管的同类型菌落1-3个，37培养24h，结果 若产酸又产气产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。，即证实有大肠菌群存在。 同类型菌落同类型菌落 深紫黑色、有金属光泽。深紫黑色、有金属光泽。 紫黑色、不带或略带金属光泽。紫黑色、不带或略带金属光泽。 淡紫红色、中心颜色较深。淡紫红色、中心颜色较深。 证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管 （瓶）数查表，即得 证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管 （瓶）数查表，即得每升水样中的每升水样中的大肠菌群数大肠菌群数。 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果
12、查表3 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查表3 将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水 样的发酵管结果查表4 将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水 样的发酵管结果查表4 五 实验报告五 实验报告 实验课程论文实验课程论文 封面格式封面格式 水处理微生物学课程实验水处理微生物学课程实验 所在班级：所在班级： 学生姓名：学生姓名： 任课教师：任课教师： 实验时间：实验时间： 实验课程论文格式实验课程论文格式： 题目题目 1 实验目的实验目的 2 基本原理基本原理 3 实验内容实验内容 4 实验步骤和方法实验步骤和方法 5 结果记
13、录结果记录 6 结果分析结果分析 7 参考文献参考文献 1 池水、河水或湖水中每升水样中大肠菌群 数 1 池水、河水或湖水中每升水样中大肠菌群 数 阳性结果记阳性结果记“+ +”；阴性结果记；阴性结果记“- -”。 查表3得每升水样中大肠菌群数是多少？查表3得每升水样中大肠菌群数是多少？ 查表4得每升水样中大肠菌群数是多少？查表4得每升水样中大肠菌群数是多少？ 0.01 0.1 1 10 100 发酵结果发酵结果水样管水样管/ml 2 思考题2 思考题 (1) 大肠菌群的定义是什么(1) 大肠菌群的定义是什么? (2) EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查 大肠菌群时，各起什么作用？ (2)
14、 EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查 大肠菌群时，各起什么作用？ 存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情 况下不致病. 存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情 况下不致病. （1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli） E.coli （1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli） E.coli （2）产气杆菌（Aerobacter aerogenes）（2）产气杆菌（Aerobacter aerogenes） （3）枸橼酸盐杆菌（Coli citrovorum）（3）枸橼酸盐杆菌（Coli citrovorum） （4）副大肠杆菌（Paracoli）（4）副大肠杆菌（Paracoli） 大肠菌群大肠菌群的生理习性与病原菌相似，并且外界 存活时间基本 的生理习性与病原菌相似，并且外界 存活时间基本一致.一致.