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1、莃羈聿莄 实验 27 阳性单菌落扩增与小量DNA制备螁羁聿目的螅 1为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA 。蒃排除自身环化。鉴定方法主要有：螀（ 1）PCR 法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR 产物。膈 （ 2）Southern blot 法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作 Southern blot 。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。膆 （ 3）酶切鉴定法及其利弊。羁 2提供一定数量的 DNA 以满足一些实验
2、，比如 1）测序、 2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。蕿 有关微型真空柱和离心柱的利弊。 原理与本实验近似， 区别在于 DNA 的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。芈薇原理蚃挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质 -膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA 、高分子量的 RNA 得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA 溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒 DNA 。薂莈实验准备蚄一器材莅 Falcon 2070 管莁 台式 Eppendorf 管离心机蒈
3、可调移液器P1000、 P200、 P20 及其经消毒的盒装蓝、黄吸头肅 经消毒的1.5ml Eppendorf 管、试管架及其水浴用试管架袂定时器、记号笔、一次性手套和筒纸膀 4和 20冰箱薈煤气灯或酒精灯蒆 恒温培养摇床（调至37， 240rpm ）薄 台式 4 Eppendorf 管离心机袈离心真空干燥器蚈 37水浴袆二试剂羂 含抗生素的LB 培养液羁 TE （ 10mM Tris ， 1mM EDTA ， pH 8.0 ）蚈 100预冷乙醇肃 75预冷乙醇螄 RNase （ 10mg/ml ）蚀 3M NaAC螈 溶液 I蒄 50 mM 葡萄糖膂 25 mMTris.Cl （ pH 8
4、.0 ）葿 10 mMEDTA （ pH 8.0 ）袇 在 10 lbf/in2 （ 6.895*104pa ）高压灭菌15 分钟，贮存于4。袅 溶液 II袄 0.2 NNaOH蒂 1SDS羇 溶液 III芆 5 M乙酸钾300 ml莂 冰乙酸58 ml芁 水142 ml肇 存于 4。蚇消毒过的双蒸水肄三实验材料肀含阳性菌落的培养皿膇碎冰及碎冰保温盛器螄薁蝿实验步骤芇 1第一天（通常为下午）膄 从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到 Falcon 管内的 5ml LB 培养液（含氨卞青霉素）中。放入 37恒温摇床， 225-250 rpm 剧烈摇晃培养过夜（ O/N ）。芃 2第二天（通常上午开始）
5、袁（1）吸取 1.5ml 培养液，移入Eppendorf 管中，台式离心机室温下1.4 万转离心2 分钟，弃上清，重复一次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4冰箱。芇 （ 2）弃上清，加入 100ul 溶液 I ，盖上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架面上，划 15 下），充分浮悬细胞沉淀，置 -20冰箱内 5 分钟。薅 （ 3）自冰箱中取出试管，加入200ul 溶液 II ，轻轻颠倒混匀，放于冰上5 分钟。蚁 （ 4）加入 150ul 溶液 III ，轻轻颠倒混匀，放于冰上15 分钟。薀 （ 5）放入台式离心机，室温下 1.4 万转离心 3 分钟，将上清移入一新的 Eppendorf 管，加
6、入 1ml 100 乙醇，混匀，放入 -20冰箱 5 分钟。莇 （ 6）自冰箱中取出试管，迅速移入4环境下的台式离心机，1.4 万转离心5 分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。羆 （ 7）加入 300ul TE 和 2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于37的水浴中温育30 分钟。莃 （ 8）加入 3M NaAC 34ul ，混匀，加入1ml预冷的100乙醇，-20存放5 分钟。荿 （ 9）自冰箱中取出试管，迅速移入4环境下的台式离心机，1.4 万转离心5 分钟，弃去上清。蒇（ 10）加入10 分钟，弃去上清。1ml预冷的75乙醇，迅速移入4环境下的台式离心机，1.4 万转离心莇
7、（ 11）旋转真空干燥10 分钟。于冰上，溶解沉淀于20ul水中。袁莂实验结果薆 通常可获得35ugDNA 。蒄薃以下无正文仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。 , .For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f r den pers?nlichen f r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden .Pour l tude et la recherche uniquement des fins personnelles; pas des fins commerciales.