《凝胶排阻色谱法研究阿胶中蛋白质及多肽相对分子质量分布规律.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凝胶排阻色谱法研究阿胶中蛋白质及多肽相对分子质量分布规律.docx（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、? 1886? 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009,29(11)凝胶排阻色谱法研究阿胶中蛋白质及多肽相对分子质量分布规律汪冰 ,肖新月 ,程显隆 ,田守生 ,林瑞超3.山东东阿阿胶股份有限公司研究所 ,聊城 252201)2*1131(1.中国药品生物制品检定所 ,北京 100050;2.山东省药品检验所 ,济南 250101;摘要目的 :建立阿胶中水溶性成分凝胶排阻色谱分析方法,研究阿胶中蛋白质及多肽的相对分子质量分布规律 ,为阿胶质量评价提供依据。方法 :采用 TSK-GELG4000PWXL(7.8mm 300mm,平均孔径 500A),流动相为 0.05mol!L-1
2、磷酸盐缓冲液 (pH=7.2),流速 0.4mL!min-1, 检测波长 280nm,以 -淀粉酶、胰岛素为标记物 , 室温下测定 16 个企业生产的 40 批阿胶样品 ,并应用 TQAnalyst 软件进行样品图谱主成分分析。结果 :发现阿胶含有的蛋白质及多肽的相对分子质量主要集中在6 1032 105,不同企业的产品中蛋白质及多肽的相对分子质量分布有一定规律。结论 :该方法准确、可靠 ,具有良好的重复性和稳定性 ,可用于阿胶中蛋白质及多肽的分析。测定结果反映出不同企业间 ,甚至同一企业不同批次产品有差异。提示阿胶原料与生产工艺值得注意 ,为保证阿胶质量稳定 ,应该进行生产过程控制。关键词
3、:阿胶 ;水溶性成分 ;蛋白质及多肽 ;凝胶排阻色谱法 ;相对分子质量分布 ;主成分分析中图分类号 :R917 文献标识码 :A 文章编号 :0254-1793(2009)11-1886-06Studyonrelativemolecularmassdistributionofproteinandpeptide indonkey-hidegluebygelexclusionchromatography WANGBing,XIAOXin-yue,CHENGXian-long,TIANShou-sheng,LINRui-chao(1.NationalInstitutefortheControlofP
4、harmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing10005 0,China;2.ShandongProvinceInstituteforDrugContro,lJinan250101,China;3.InstituteforDrugControlofShandongDongEEJiaoCO.LTD.,Liaocheng252000,China)21*131Abstract Objective:Todevelopagelexclusionchromatographymethodforstudyofrelative molecularmassdistri but
5、ionofproteinandpeptideindonkey-hideglue.Methods:GPCwasperformedonaTSK-GELG4000PWXLcolumn(7.8mm 300mm,averageporesize500A)with0.05mol!L -135 -1phosphatebufferedsolution(pH7.2)attheflowrateof0.4mL!min,anddetectionat280nm.Re sults:Relativemolecularmassofproteinandpep tideindonkey-hideglueisintherangeso
6、f6 10-2 10,andthereareregularpatternintherelativemolecularmassdistributionofproteinandpeptideindonkey-hideglue.Conclusion:Thedevelopedmethodisaccuratewithhighrepeatabilityandstability,whichcanbeusedfortheanalysisofproteinandpeptideindonkey-hideglue.Theresultshowsthattherearedifferenceinproductsamong
7、differentmanufacture,evenamongdifferentbatchs,whichcausedbydifferentproductiontechnique.Thecontrolofproductproductionprocessisveryimportanttoensurethequalityofdonkey-hideglue.Keywords:donkey-hideglue;water-solubleconstituen;tproteinandpeptide;gelexclusionchromatography;dis tributionofrelativemolecul
8、armass;analysisofmainconstituent阿胶是马科动物驴 (EquusasinusL.)的皮经煎熬浓缩而成的干燥胶块。药用历史已有2000多年 ,从古至今 ,一直作为滋阴润燥补血止血的良药。其主要成分为胶原蛋白部分水解产生的多肽、多种氨基酸、金属元素及硫酸皮肤素、生物酸等 1 阿胶的质量 ,该方法测定的总氮量包括有机氮和无机氮 ,方法粗放 ,专属性不强。为增强阿胶质量的可控性 ,作者建立了柱前衍生化 HPLC 法测定阿胶中羟脯氨酸及胶原蛋白的主要水解氨基酸甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量的方法 2 。该方法准确、可靠 ,具 2005 年版中国药典采用定氮法测定总氮量以控制(-
9、i:lorg. 有良好的重复性和稳定性。然而 ,该方法测定的是药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009,29(11)?-11887?阿胶水解后的氨基酸 ,不足以反映组成阿胶的蛋白质类成分的原生状态。为此 ,本文研究建立了阿胶中水溶性成分凝胶排阻色谱分析方法 (gelexclusionchromatography,简称 GPC 法),不经水解直接分析阿胶中的可溶性蛋白质及多肽的相对分子质量分布规律 ,并比较 16 个企业 40 批产品的差异 ,以期更客观、科学地评价阿胶的质量情况。1 仪器与试药Agilent1100 高效液相色谱仪 ;实验样品阿胶为 2007 年对不同生产厂家进行药品
10、评价性抽验留样的样品 (见表 1)。相对分子质量标记物 -淀粉酶 (批号 :054k6104)购自 Sigma 公司 ,胰岛素 (批号 :0633-200703)由中国药品生物制品检定所提供 ,均为供含量测定用。试剂磷酸氢二钠、氢氧化钠均为分析纯 ;纯净水为 Milli-Q 纯水。表 1 实验用 40 批阿胶样品Tab1生产企业得 ),流速为 0.4mL!min, 检测波长为 280nm。3 溶液配制3.1标记物溶液取-淀粉酶、胰岛素适量 ,精密称定 ,加水制成每 1mL 分别含-淀粉酶 0.8mg、胰岛素 1.0mg 的混合溶液。 3.2 供试品溶液 取阿胶样品 250mg, 置于 25mL
11、 量瓶中 ,加水约 20mL,超声处理 (功率 300W,频率 50kHz)30min, 放冷 ,加水定容至刻度 ,摇匀 ,用微孔滤膜 (0.45 m)滤过 ,即得。 4 分析方法验证4.1系统适应性及专属性试验取标记物溶液、供试品溶液及空白溶液(水)各5 L,按 ? 2.2%项下色谱条件进行测定 ,理论板数按胰岛素计算为 4034,分离度大于1.5,空白无干扰。信噪比 (S/N)以 b 峰与噪音的比值计算为 17。标记物溶液、供试品溶液凝胶排阻色谱图见图 1。Fourtysamplesofdonkey-hideglue编号生产企业批号编号批号(manufacturer)(LotNo.)(sa
12、mpleNo.)(manufacturer)(LotNo.)(sampleNo.)070746A070771070812070523B07052207052120070414C2007041520070503D2007050520070507070702-3E070703-4070706-420070402F2007040320070404070113G070202070203A1A2A3B1B2B3C1C2D1D2D3E1E2E3F1F2F3G1G2G3NOPMLKJIH2007041420075112007515070202807020300702031200703052007032320
13、07041407042007042207042320070210200703022007030820070010120070103070601070307070202H1H2H3I1I2I3J1J2J3K1K2K3L1L2L3M1M2NOP图 1混合标记物 (M) 和 A3 样品凝胶排阻色谱图Fig1GPCchromatogramsofmixmarker(M)andsampleA31淀.粉酶(amylase,19.92min) 2.胰岛素 (insulin,31.38min)4.2精密度试验取 A3 号样品的供试品溶液5L,按 ? 2%项下色谱条件连续进样6 次,测定在 40 批样品均出现的保
14、留时间为 12.5min 色谱峰的峰面积 ,计算其 RSD 为 1.6%。另外 ,供试品溶液为水溶液 ,不宜放置过久。4.3 重复性试验 精密称取 A3 号样品 6 份,每份 250mg,按? 3.2%项下方法制备供试品溶液 ,按 ? 2%项下色谱条件测定保留时间为 12.5min 峰的峰面积 ,计算其 RSD 为 2.0%。5 结果与分析按上述条件 ,以-淀粉酶 (相对分子质量约532 15 10)和胰岛素 (相对分子量约 5.7 10)作为相对分子质量标记物 ,对 16 个不同企业生产的 40 批阿胶样品测定 ,结果见图 2。2 色谱条件色谱柱为 TSK-GELG4000PWXL(7.8mm300mm,平均孔径 500),柱温为室温 (25#),流动相为 005mol!L 磷酸盐缓冲液(pH=7.2)(取磷酸二氢钠 27g,加水使溶解成 1000mL,取 50mL, 加 0.2mol!L-1? 1888? 药物分析杂志ChinJPharmAnal2009,29(11)