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1、序页 / 总页： 1/ 7#制药有限公司 GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标准操作规程编号： #制 定 人审 核 人批 准 人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量部颁发日期生效日期分发部门制作份数修 订 号修订日期版 本 号00目的：制定农药残留量测定法的检验标准，使检验有据可依。范围：本公司药材农药残留量的测定。责任人：质检中心负责人及检验员。依据：中国药典 2010 年版一部。内容：1 本法系用气相色谱法测定药材、饮片及制剂中部分有机氯、有机磷和拟除虫菊酯类农药，除另有规定外，按下列方法测定。2 有机氯类农药残留量测定2.1仪器与用具：2.1.1 气相色谱仪带 有 63Ni-ECD
2、 电子捕获检测器， 载气为高纯氮 (纯度 99.9999%)，必须安装脱氧管 (购自 )。2.1.2超声仪。2.1.3离心机。2.1.4旋转蒸馏发仪。2.1.5色谱柱：SE54 或 DB-1701 弹性石英毛细管柱 (30m0. 32mm0. 25m)2.1.6具塞刻度离心管00 mI)，刻度浓缩瓶， 具塞锥形瓶 100ml)，移液管等。2.2试药与试液2.1.1 丙酮、石油醚 (6090 )和二氯甲烷均为分析纯，且全部经过全玻璃蒸馏馏装置重蒸馏馏，经气相色谱法确认，符合农残检测的要求。 (有条件的实验室可使用进口的农残级的试剂 )2.1.2无水硫酸钠钠和氯化钠均为分析纯，硫酸钠为优级纯。2.
3、1.3农药对照品：六六六（ BHC ）包括 -BHC ， -BHC ， -BHC 和 -BHC 四种异构体 ，滴滴涕（ DDT ） 包括 pp-DDE，pp-DDD ，op-DDT 和 pp-DDT 四种异构体 及序页 / 总页： 2/ 7#制药有限公司GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标准操作规程编号： #五氯硝基苯 (PCNB) ，由中国计量科学研究院提供标示含量（浓度）的农药标准品，也可采用国际认可的农药标准品自行配制。2.3 色谱条件与系统适用性试验2.3.1SE-54 色谱柱：进样口温度： 230。检测器温度： 300，不分流进样。程序升温：初始温度 100，每分钟 10升至
4、220，再以每分钟 8升至 250，保持 10min。2.3.2 DB-1701 色谱柱：进样口温度： 220，检测器温度： 300，不分流进样。程序升温：初始温度 140，保持 lmin ，以每分钟 10升至 210，再以每分钟 20升至 260，保持 4min。按上述条件操作，理论板数以BHC 峰计算应不低于1 106，两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。2.4操作方法2.4.1 对照品储备液的制备 精密称取六六六 (BHC) -BHC ，-BHC ，-BHC 和 -BHC 、 滴滴涕（ DDT)PP-DDE ， PP-DDD， OP-DDT， PP-DDT 及五氯硝基苯 (PCNB)
5、农药对照品溶液适量， 用石油醚 (6090)分别制成每 1ml 含 45 g 的溶液。2.4.2制备精密量取上述各对照品储备液0. 5ml ，置 10ml 量瓶中，用石油醚 (6090)稀释至刻度，摇匀。2.4.3混合对照品溶液的制备精密量取上述混合对照品储备液，用石油醚(6090)制成每 1L 分别含 0g，1g，5g，10g， 50g，100 g 和 250 g 的溶液。2.5.4供试品溶液制备2.5.4.1方法 1（药材）取供试品于 60干燥 4h，粉碎成细粉，取约2 g，精密称定，置 100 ml 具塞锥形瓶中，加水20 ml 浸泡过夜，精密加丙酮40ml，称定重量，超声处理30min
6、，放冷，再称定重量，用丙酮补足减失的重量，再加氯化钠约6 g，精密加二氯甲烷 30 ml ，称定重量，超声处理 15min，直至氯化铀完全溶解，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量， 静置使水相与有机相完全分层， 将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠钠的 100 ml 具塞锥形瓶中，脱水 4h，精密量取 35ml，置 100 ml 旋转蒸馏发瓶中， 40序页 / 总页： 3/ 7#制药有限公司GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标准操作规程编号： #水浴上减压浓缩至近干，加少量石油醚 (6090)如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，用石油醚 (6090)溶解并转移至 10 ml 具塞刻度离心管
7、中，加石油醚 (6090 )精密稀释至 5ml ，小心加入硫酸钠 1 ml，振摇 1min，离心 (3000r/min) 10min ，精密量取上清液 2ml，置刻度浓缩瓶中，连接旋转蒸馏发器， 40下 (或用氮气 )将溶液浓缩至适量，精密稀释至1 ml，即得。同法制备空白样品。2.5.4.2 方法 2（制剂） 取供试品，研成细粉 (蜜丸切碎，液体直接量取 )，精密称取适量 (相当于药材 2g)，以下按方法 1，制备供试品溶液。2.6测定法按上述色谱条件操作，分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各 1l ，分别连续进样 3 次，取 3 次平均值，按外标法计算供试品中9 种有机
8、氯农药残留量。2.7注意事项2.7.1本试验所用器皿应严格清洗 (不能残存卤素离子 )。2.7.2供试品溶液制备时，有机相减压浓缩务必至近干，避免待测成分损失。2.7. 3为防止假阳性结果，可选择不同极性的色谱柱进行验证，有条件的可采用气质联用予以确认。2.7.4如样品中其它成分有干扰，可适当改变色谱条件也但需进行空白验证。3 有机磷类农药残留量测定3.1仪器与用具3.1.1气相色谱仪，带有氮磷检测器(NPD)，载气为高纯氮 (纯度 99.9999%)。3.1.2超声仪。3.1.3旋转蒸馏发仪。3.1.4多功能真空样品处理器。3.1.5活性炭小柱120400 目，石墨碳填料0.25g，内径 0
9、.9cm， 3ml)。3.1.6氮吹仪 (Organomation Associates， Inc.， N-EV AP TM 112 nitrogen evaporator)。序页 / 总页： 4/ 7#制药有限公司GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标准操作规程编号： #3.1.7色谱柱： DB-17MS 或 HP-5 弹性石英毛细管柱 (30m0. 25mm0.25m)或类似极性的毛细管柱。3.1.8具塞锥形瓶、 250ml 平底烧瓶、棕色量瓶、移液管等。3.2试药与试液3.2.1无水硫酸钠为分析纯。3.2.2乙酸乙醋、正己烷 (农残级或分析纯试剂经过全玻璃蒸馏装置重蒸馏，经气相色谱法
10、确认，符合农残检测的要求)。3. 2.3 农药对照品：对硫磷、甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪农、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酷甲胺磷，由中国计量科学研究院及农业部环境保护科研检测所提供，其纯度大于 99%；也可以使用国际认可的、纯度要求等符合规定的进口标准物质。3.3色谱条件与系统适用性试验进样口温度： 220。检测器温度： 300。不分流进样。程序升温：初始 120，每分钟 10升至 200，每分钟 5升至 240，保持 2min，每分钟 20升至 270，保持 0.5min。理论板数按敌敌畏峰计算应不低于 6000，两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。3.4操作
11、方法3.4.1 对照品储备液的制备 精密称取对硫磷、 甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪农、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷农药对照品适量，用醋酸乙醋分别制成每1ml 约含 100 g 的溶液，即得。3.4.2混合对照品储备液的制备精密量取上述各对照品储备液1ml，置 20ml 棕色量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得。3.4.3混合对照品溶液的制备精密量取上述混合对照品储备液，用乙酸乙酯制成每1ml分别含 0.1g、0. 5g、1g、2g、5g 的溶液，即得。3.4.4供试品溶液的制备药材取供试品粉末 (过二号筛 )约 5g，精密称定，加无水硫酸钠 5g，加入乙
12、酸乙酯 50100ml，冰浴超声处理 3min，放置，取上层液滤过，药渣加乙酸乙酯 30 50ml，冰浴超声处理2min，放置，滤过，合并两次滤液，用少量乙酸乙酯洗涤滤纸及残渣，与上述滤液合并。 取滤液于 40下减压浓缩至近干， 用乙酸乙酯转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取1ml，置活性炭小柱 l20400 目， 0.25g，内径 0. 9cm，(如 Supelclean ENVICarb SPE Tubes， 3ml 活性炭小柱 )，用乙酸乙酯5ml 预洗 上，置多序页 / 总页： 5/ 7#制药有限公司GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标准操作规程编号： #功能真空样品处理器
13、上，用正己烧乙酸乙酯置氮吹仪上浓缩至近干，精密加入乙酸乙酯1：1)的混合溶液 5ml 洗脱，收集洗脱液，1ml 使溶解，即得。同法制备空白样品。3.5.5测定法按上述色谱条件操作， 分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各 11，分别连续进样 3 次，取 3 次平均值，按外标法计算供试品中12 种有机磷农药残留量。3.6注意事项3.6.1所用玻璃仪器不能用含磷洗涤剂洗涤，应用洗液浸泡洗涤， 使用前用丙酮荡洗并挥干溶剂。3.6.2乙酸乙酯提取液减压浓缩时，水浴温度不能高于40，且减压浓缩务必至近干，避免待测成分损失。3.6.3为防止假阳性结果， 可选择不同极性的色谱柱进行验证，有
14、条件的可采用气质联用 予以确认。3.6.4本项方法的加样回收率应为70%110%。3.6.5如由于具体试验要求对本操作规程的色谱条件及操作步骤进行了修改，应在原始记录上予以记录。4 拟除虫菊酯类农药残留量测定4.1仪器与用具4.1.1气相色谱仪（如 PE-9000,Varian6000,Shimadzu GC-17A等），带有 63Ni-ECD 电子捕获检测器。载气为高纯氮，必须安装脱氧管。4.1.2超声仪。4.1.3离心机。4.1.4旋转蒸发仪。4.1.5色谱柱： SE-54 或 DB-5 弹性石英毛细管柱（ 30m0.32mm0.25 m）。4.1.6具塞锥形瓶、圆底烧瓶、量瓶、移液管等。
15、4.2试药与试液4.2.1丙酮、石油醚（ 6090）和乙醚均为分析纯，且全部经过全玻璃蒸馏装置重蒸馏，经气相色谱法确认， 符合农残检测的要求 （有条件的实验室可使用进口的农残级的试序页 / 总页： 6/ 7#制药有限公司GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标准操作规程编号： #剂）。4.2.2无水硫酸钠、氧化铝（ 80100 目）、微晶纤维素为分析纯。4.2.3弗罗里硅土（ Florisil 80100 目， Supelco 公司）。4.2.4 农药对照品：氯氰菊酯，氰戊菊酯，溴氰菊酯对照品（由中国计量科学研究院提供），纯度大于 98%。4.3色谱条件与系统适用性试验进样口温度： 270，
16、检测器温度： 330，分流或不分流进样，分流比： 20：1；5：1。程序升温：初始160，保持 1min，每分钟 10升至 278，保持 0.5min，每分钟 1升至 290，保持 5min。理论板数按溴氰菊酯峰计算应不低于 1105，两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。注：操作中可根据样品实际情况， 选择 1min 后分流进样，初始 50（低于溶剂沸点 10，以每分钟 30升至 160，保持 1min，以每分钟 10升至 278，保持 0.5min，再以每分钟 1升至 290，保持 5min。4.4操作方法4.4.1对照品储备液的制备精密称取氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯农药对照品适量，用石
17、油醚（6090）分别制成每 1ml 含 2025 g 的溶液，即得。4.4.2混合对照品储备液的制备精密量取上述各对照品溶液储备液1ml，置 10ml 量瓶中，用石油醚（ 6090）稀释至刻度，摇匀，即得。4.4.3混合对照品溶液的制备精密量取上述混合对照品储备液， 用石油醚（6090）制成每 1L 分别含为 0g、4g、8 g、 40g、200 g 的溶液，即得。4.4.4 供试品溶液的制备药材 取供试品于 60干燥 4h，粉碎成细粉（过五号筛），取约 12g，精密称定，置 100ml 具塞锥形瓶中，加石油醚（ 6090） -丙酮 (4：1)混合溶液30ml，超声处理 15min，滤过，药渣
18、再重复上述操作 2 次后，合并滤液，滤液加入适量无水硫酸钠脱水后，置 100ml 圆底烧瓶中，于 4045减压浓缩至近干，用少量石油醚（ 6090）反复操作至丙酮除净，残渣用适量石油醚（ 6090）溶解，置玻璃层析柱混合小柱（内径 11.5cm 的玻璃柱），从下至上依次为无水硫酸钠 2g、弗罗里硅土 4g、微晶纤维素 1g、氧化铝（ 100 目） 1g 和无水硫酸钠 2g，用石油醚（ 6090） -乙醚 (4：1)混合溶液 20ml 预洗上，用石油醚（ 6090） -乙醚 (4：1)混合溶液 90ml 洗脱，收集序页 / 总页： 7/ 7#制药有限公司GMP 标准文件文件名称农药残留量测定法标
19、准操作规程编号： #洗脱液，于 4045减压浓缩至近干，再用石油醚（ 6090） 34ml 重复操作至乙醚除净，残渣用石油醚（ 6090）溶解转移至 5ml 量瓶中，并稀释至刻度，即得。同法制备空白样品。4.5测定法按上述色谱条件操作，分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各1l ，分别连续进样 3 次，取 3 次平均值，按外标法计算供试品中3 种拟除虫菊酯农药残留量。4.6注意事项4.6.1本试验所用器皿应严格清洗（不能残存卤素离子） 。4.6.2供试品溶液制备时，有机相的减压浓缩务必至近干，避免待测成分损失。4.6.3由于中药样品组成复杂， 特殊样品要视具体情况适当改变提取、净化条件。4.6.4为防止假阳性结果， 可选择不同极性的色谱柱进行验证，有条件的可采用气质联用予以确认。5 文件变更记录：文件名称文件编号变更原因变更时间