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1、第三章 核酸和核苷酸,认识核酸在生命科学上的重要性 弄清碱基、核苷、核苷酸和核酸分子结构上的关系 了解核酸的化学本质及DNA和RNA在组分、结构和功能上的差异 认识核酸的结构与其性质与功能之间的关系。,学习要求,上页 下页 章首,1868年 F.Miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为“核素”的核酸 1944年 O.N.Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质 1953年 J. D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA 双螺旋结构模型 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则 1970s 建立DNA重组技术 1980s后 分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进
2、发展，提出并完成HGP,核酸化学的发展过程,上页 下页 章首,一. 核酸的概念和重要性 二. 核酸的化学组成及其基本结构单位核苷酸 三. 核酸的一级结构及其测定 四. DNA的高级结构 五. RNA的高级结构 六.核酸和核苷酸的理化性质 七.核酸的分离提取和纯化,本章目录,上页 下页 章首,一.核酸的概念和重要性,核酸的概念 核酸的重要性,上页 下页 章首,核酸的概念,核酸是酸性的大分子物质，在活细胞中与碱性蛋白结合，以核蛋白形式存在。 核酸分为脱氧核糖核酸 ( DNA )以及核糖核酸 (RNA)两类，DNA所含核苷酸分子数比RNA大得多。 RNA分为三个类型，即核蛋白体 RNA(rRNA)、
3、信使RNA(mRNA)和转移RNA(tRNA)，它们都参与蛋白质合成,上页 下页 章首 节首,脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比,上页 下页 章首 节首,DNA和RNA,返回,DNA是遗传的物质基础，负责遗传信息的贮存和发布，遗传基因就是DNA链上的若干核苷酸所组成的片段。 RNA负责遗传信息的表达，直接参与蛋白质生物合成，转录DNA所发布的遗传信息，并将之翻译给蛋白质，使生命机体的生长、发育、繁殖和遗传得以继续进行。,核酸的重要性,上页 下页 章首 节首,核酸类物质RNA的重要功能,返回,二.核酸的化学组成及其基本结构单位核苷酸,核酸的化学组成 核酸的基本结构单位核苷酸,上页 下页 章首,核酸
4、的化学组成,元素组成：C、H、O、N、P P元素的含量较多并且恒定，约占911%。 核酸在酸、碱或酶作用下会水解成核苷酸，进一步水解可得碱基(嘌呤或嘧啶)，戊糖(核糖或脱氧核糖) 和磷酸,上页 下页 章首 节首,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,(一)戊糖,上页 下页 章首 节首,(二)碱基(嘌呤和嘧啶）,上页 下页 章首 节首,常见的嘌呤和嘧啶,上页 下页 章首 节首,(三)核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,上页 下页 章首 节首,嘧啶核苷,嘌呤核苷,几种稀有核苷,上页 下页 章
5、首 节首,几种稀有核苷,上页 下页 章首 节首,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,上页 下页 章首 节首,腺苷酸,脱氧腺苷酸,（四）核苷酸（nucleotide）脱氧核苷酸,上页 下页 章首 节首,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸,上页 下页 章首 节首,（五）核苷酸衍生物,上页 下页 章首 节首,1. 继续磷酸化,（五）核苷酸衍生物,上页 下页 章首 节首,2.环化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鸟苷酸(特鲜味精),4. 辅酶 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,上页 下页 章首 节首,三. 核酸的一级结构及其测定,核酸的一级
6、结构 核苷酸序列分析,上页 下页 章首,核酸的一级结构,核酸的一级结构是核酸中各核苷酸化学键连接方式即核苷酸排列顺序。 核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接起来，以磷酸-糖-磷酸-糖形成核酸骨架,上页 下页 章首 节首,RNA，DNA一级结构示意图,上页 下页 章首 节首,核酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,若不特别注明，一般规定从5端书写至 3端,上页 下页 章首 节首,核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例。先以外切酶确
7、定5-或3-末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列。最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。,核酸序列分析,上页 下页 章首 节首,核苷酸序列分析中断裂磷酸二酯键用酶,返回,DNA酶法测序,1977年sanger发明末端终止法测定DNA序列 根据sanger测序法，现在已经有各种DNA自动测序仪，DNA测序速度大大加快HGP得以提前完成,上页 下页 章首 节首,DNA酶法测序,上页 下页 章首 节首,DNA酶法测序,上页 下页 章首 节首,平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各
8、加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示：,DNA酶法测序,上页 下页 章首 节首,DNA酶法测序,上页 下页 章首 节首,四. DNA的高级结构,DNA的二级结构 DNA的三级结构,上页 下页 章首,DNA的二级结构,DNA的二级结构是双螺旋结构，即两条多聚核苷酸链围绕一个共同轴，相互盘绕在一起构成直径 2nm的双螺旋，互补的碱基(A和T互补 ，G和C互补)通过氢键连接在螺旋内部，碱
9、基平面垂直于右旋的螺旋轴。螺旋结构中两条链走向相反,上页 下页 章首 节首,DNA的二级结构类型,上页 下页 章首 节首,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（AT，GC）碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周为10碱基对（bp） A型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。 Z型结构 左手螺旋，只有小沟,DNA双螺旋结构示意图,返回,DNA的分子节段及碱基配对示意图,返回,稳定DNA双螺旋结构的三种力量 氢键：使四种碱基形成特异配对关系，G-C间可形成3对氢键，A-T之间有两对氢键 。 疏水相互作用：轴向平行相邻的碱基平面自发地相互靠近，从而使碱基缔合、层层堆积，
10、形成了碱基堆积力 ，它是使DNA结构稳定的主要力量。 离子键：磷酸残基上的负电荷与介质中的正离子，如Na+，K+，g等之间形成的离子键。,上页 下页 章首 节首,核酸的三级结构指链状核酸分子的空间构型，即其三维空间排列或组合方式。,DNA的三级结构,上页 下页 章首 节首,DNA的三级结构主要有以下三种：,松弛环形,超螺环形,开链环形,DNA的三级结构,上页 下页 章首 节首,回文结构与镜像结构,特殊DNA的结构,上页 下页 章首 节首,回文结构中的单链可形成发夹结构,特殊DNA的结构,上页 下页 章首 节首,双链回文结构可形成十字架结构,特殊DNA的结构,上页 下页 章首 节首,DNA和基因
11、组,DNA通过自我复制合成出完全相同的分子，从而将遗传信息由亲代传到子代。 转录，以DNA为模板合成RNA的过程，碱基配对。 mRNA用于指导蛋白质的合成，mRNA的核苷酸的序列决定了蛋白质的氨基酸序列；,中心法则,几个基本概念,遗传学将DNA分子中最小的功能单位称作基因 基因:能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。 为RNA或蛋白质编码的基因称结构基因 DNA中还有一些只有调节功能，而并不转录生成RNA的片断称调节基因。 某生物体所含有的全部基因称该生物体的基因组。,原核生物基因组特点,大多为结构基因 串联基因 基因重叠,真核生物基因组特点,重复序列 断裂基因,五. RNA的
12、高级结构,RNA的二级结构 RNA的三级结构,上页 下页 章首,RNA的二级结构,RNA的二级结构基本上是单股分子，其二级结构比DNA简单的多，但也存在少数碱基配对区域即双螺环结构。,RNA单链的折叠,上页 下页 章首 节首,（1）占总RNA的15 （2）一种氨基酸对应最少一种RNA （3）分子中含有较多修饰成分 （4） 3-末端都具有CCAOH结构 （5）半数碱基可经过自身回折，形成局部双螺旋“茎” 结构，其间是单链形成的“环”。绝大多数tRNA经过这样的折叠形成4个茎和4个环组成的特征性三叶草形二级结构 。,上页 下页 章首 节首,1、tRNA,占总RNA的80,上页 下页 章首 节首,2
13、、rRNA,5sRNA的二级结构,占总RNA的35,上页 下页 章首 节首,3、mRNA和hnRNA,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为” 帽结构“ 。,占总RNA的35,上页 下页 章首 节首,3、mRNA和hnRNA,原核生物mRNA特征： 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列 真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5ppp5-N-3p）+单顺反子+ “尾巴”（Poly A）,原核细胞mRNA的结构特点,真核细胞mRNA的结构特点,在tRNA二级结构中未配对的某些并不互补的碱基参与了三
14、级结构中特殊的氢键作用，tRNA链中的核糖-磷酸骨架与某些碱基甚至其他的骨架之间也能产生作用。,RNA的三级结构,上页 下页 章首 节首,六.核酸和核苷酸的理化性质,核苷是无色的晶体或粉末，熔点较高。在水中的溶解度嘧啶核苷比嘌呤核苷大，在有机溶剂中一般不溶解。由于戊糖有不对称的C原子，使其具有旋光性。 天然DNA分子长度可达几厘米，而分子直径只有20埃米。这种细丝状的双螺旋结构赋于DNA 一系列显著的物理化学特性。 由于RNA分子比DNA短 而且小的多,只有部分双螺旋结构区，呈不定形，没有像 DNA那样明显的物理、化学特性。,上页 下页 章首,沉降特性 高分子量 高粘度 紫外吸收 酸碱性质 变
15、性复性,核酸和核苷酸的理化性质,上页 下页 章首 节首,溶液中的核酸在引力场中可以下沉，在超速离心机造成的极大的引力场下，核酸分子下沉的速率大大加快。应用超速离心技术，可以测定核酸的沉降常数、分子量和构象。测定DNA分子量时，由于它的粘度大，应采用其稀溶液。,沉降特性,上页 下页 章首 节首,目前核酸的分子量用电子显微镜照相，放射自显影凝胶电泳等技术来测定。 部分核酸分子量和核苷酸数：,高分子量,上页 下页 章首 节首,DNA的粘度比RNA的大得多。当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生螺旋向线性过渡时，粘度会降低。,高粘度,上页 下页 章首 节首,由于核酸组分嘌呤和嘧啶具有强烈的紫外吸收性能
16、，所以核酸也有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260nm处。这可作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,紫外吸收,上页 下页 章首 节首,酸碱性质,上页 下页 章首 节首,核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,在一定物化因素(热、酸、碱 作用下)，DNA分子内的氢键断裂，双螺旋结构解开，发生变性。 RNA仅局部呈双螺旋结构，其螺旋形结构向线团形结构转化不如DNA明显。 核酸降解、变性时，其对紫外吸收增加，这种现象称为增色效应 变性DNA在适
17、当条件下(如缓慢冷却)可使两条分开的链重新缔合成双螺旋结构，这过程叫复性。复性过程产生减色效应,变性与复性,上页 下页 章首 节首,DNA热变性及复性示意图,返回,DNA热变性的Tm值,返回,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关，G和C的含量高，Tm值高。 可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,七.核酸的分离提取和纯化,DNA的分离 RNA的分离 核酸含量测定：定磷法 紫外线吸收法 定糖法 核酸的纯化
18、及其要求,上页 下页 章首,核蛋白的提取：真核细胞中DNA常和组蛋白结合以核蛋白形式存在，把真核细胞捣碎后加入0.9%NaCl和0.01M柠檬酸钠溶液，使DNA蛋白质沉淀，而柠檬酸钠是起抑制DNA的降解作用。 核酸与蛋白质的分离：利用核蛋白溶于1mol /L NaCl的性质，将其从细胞匀浆中分离出来，用饱和苯酚等溶剂与上述核蛋白共振，冰冻离心。 DNA溶于上层水相中，变性蛋白留在酚层内。在水相加入2.5倍体积无水乙醇，将其沉淀出来，再以核酸酶水解以除去RNA。最后借助密度梯度平衡超速离心法或层析柱法，分离DNA。,DNA的分离,上页 下页 章首 节首,DNA的精制：制得的DNA中还含少量蛋白质
19、等杂质，将它溶解在蒸馏水中，加入阴离子去污剂硫酸十二酯钠进一步作用于DNA和蛋白，使蛋白质与核酸分离而沉淀，通过高速离心去掉蛋白质，在上层DNA溶液加入95%乙醇沉淀DNA，经过乙醇重复洗几次，可得DNA精制品。,上页 下页 章首 节首,核蛋白的提取：将细胞破碎制成匀浆，再用0.14mol /L NaCl溶液将细胞质的核糖核蛋白体抽提出来，留下含DNA的细胞核组织，核糖核蛋白可在pH4.5溶液中沉淀析出。 核酸和蛋白质的分离：含水的酚能沉淀蛋白质，核酸和多糖则溶于水层。水层中的RNA和多糖可被乙醇沉淀，将沉淀再溶于磷酸盐缓冲液，然后用-甲氧乙醇抽提RNA，用乙醇沉淀得RNA。,RNA的分离,上
20、页 下页 章首 节首,RNA的精制： 在粗制的RNA中加入磷酸盐，醋酸盐，乙二醇甲醚并搅拌，使多糖类物质溶于水里，RNA溶于乙二醇甲醚内，静置分层。从上层乙二醇甲醚取出加醋酸钠，用十六烷基三甲基溴化胺盐使 RNA 沉淀，经离心分离得RNA。,上页 下页 章首 节首,将试剂用浓硫酸或过氯酸消化，使核酸磷转化成为无机磷酸。磷酸能与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂存在下，可被还原生成钼蓝，再通过测定无机磷酸测定核酸。 通常RNA平均含磷9.4%,而DNA含磷9.9% 。这样可从含磷量推算出核酸的含磷量。,定磷法,上页 下页 章首 节首,利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性，在260nm下，
21、每ml含1g DNA的消光值(O.D.260)为0.020，每ml含1ug RNA的消光值为 0.022，由未知溶液的消光值可计算出其中核酸含量。,紫外线吸收法,上页 下页 章首 节首,RNA与浓硫酸共热会降解，生成的核糖进而转化为糖糠，它与地衣酚在CuCl2或FeCl3催化下反应呈鲜绿色，在670nm处呈现最大光吸收。 DNA经加热酸解后，水解所得的脱氧核糖转变为-羟-酮戊醛，再与二苯胺生成蓝色物质。在595nm处呈现最大光吸收。 RNA和DNA在20200g/ml浓度时，光密度与核酸的浓度呈正比。,定糖法,上页 下页 章首 节首,为保持核酸的生物活性，分离、分析必须在温和条件下进行，防止过酸 、过碱、 强烈搅拌。,核酸的纯化方法,上页 章首 节首,