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1、第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 氨基酸发酵能否成功，产酸高低，取决于其反馈调节机制是否被解除和解除得是否彻底。氨基酸的发酵生产，最有效的方法就是造就从遗传角度解除氨基酸生物合成正常代谢调控机制的突变株。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 优点： 若不能从野生型、营养缺陷型得到生产菌株时，可以通过此法获得生产菌株；不受培养基成分的影响，生产较稳定。如有合适的结构类似物
2、，选育结构类似物抗性突变株，简单易得。易于保存而不易发生回复突变。只要在保存培养基中添加适量的结构类似物，就能有效的防止出现回复突变。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 筛选方法： 结构类似物添加到培养基中，选择性生长。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 机理： 作为假反馈调节剂：象对应氨基酸一样与变构酶的变构部位结合，抑制变构酶的活性。不可逆。 作为假反馈阻遏剂。象对应氨
3、基酸一样作为辅阻遏物，阻遏酶的合成。 抑制与对应氨基酸有关的氨酰基-tRNA合成酶的活性。 抑制对应氨基酸向细胞内摄取。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 育种实例： 苏氨酸结构类似物：a-氨基-羟基戊酸，黄色短杆菌，苏氨酸14g/L 赖氨酸结构类似物：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸，赖氨酸盐30g/L,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (2) 利用酶底物专一性宽的育种策略 找不到有效结构类似物，如果
4、有底物专一性宽的酶，则可利用该酶对其它底物的活性，选育代谢调节突变株。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.2 优先合成的变换 在分支合成途径的调节中，因分支点处的优先合成与反馈控制，优先合成的变换会引起一种终产物的过剩合成。 高丝氨酸脱氢酶(HD) 苏氨酸 抑制 蛋氨酸 蛋氨酸（过量）,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.3 增加前体物的积累 (1) 在分支合成途径中，切断其它合成途径，增加目的氨基酸的前体，提高目的氨基酸的产量。 (2) 其它终产物是目的氨基酸生物合成的前体，设法解除目的
5、氨基酸自身合成的反馈调节，也可设法解除对其前体物合成的调节。 苏氨酸是异亮氨酸的前体物。解除异亮氨酸、苏氨酸生物合成的反馈调节。 (3) 使分支点处的中间产物增多，导致目的氨基酸的积累增加。,第八章 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,谷氨酸发酵的代谢途径如下图所示,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.4 除去终产物 改变细胞膜渗透性 移去发酵液中的产物,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.5 利用特殊调节机制育种 (1) 多种产物控制机制的利用 黄色短杆菌，产生赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨
6、酸。 丧失高丝氨酸脱氢酶(HD)，则赖氨酸积累。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.5 利用特殊调节机制育种 (2) 平衡合成的利用 在平衡合成机制中，由于第二个终产物的过剩逆转反馈控制，所以尽管存在反馈控制机制，也能积累目的氨基酸。 葡萄糖 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 草酰乙酸 乙酰CoA 天冬氨酸 柠檬酸,黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰CoA形成的平衡合成,丧失柠檬酸合成酶,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.5 选育条件突变株 温度敏感型突变、抑制性突变、链霉素依赖性突变、低温敏感型突变等
7、，因环境条件的不同能显示野生型特性又能显示突变型特性的突变称为条件致死突变，条件突变。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.7 选育不生产副产物的突变株 (1) 有共用前体物的其它分支途径或目的氨基酸是其它氨基酸合成的前体物时，应切断其它分支途径或目的氨基酸向其它氨基酸合成的代谢流。 (2) 存在有目的氨基酸分解途径时，应选育丧失目的氨基酸分解酶的突变株。 (3) 副生氨基酸，特别是不利于目的氨基酸精制的副生氨基酸，应设法切断其代谢流。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.9 氨基酸产生菌的
8、定向育种途径 发酵生产氨基酸，多采用营养缺陷型、抗结构类似物或具有多重遗传标记的突变株。避免盲目性。 研究目的氨基酸生物合成途径、遗传控制、代谢调节与关键酶。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.2.1 利用原生质体融合技术选育氨基酸产生菌,原生质体融合操作步骤 标记菌株的选择 原生质体的制备 原生质体的再生 原生质体的融合 融合子的选择 实用性菌株的筛选,8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌,8.2.2 利用转导法选育氨基酸产生菌 转导法-通过温和型噬菌体为媒介，将供体细胞中的DNA片段携带到受
9、体细胞中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。 (1) 选育组氨酸产生菌 野生菌 组氨酸酶缺陷菌株Hd-16 亚硝基胍 突变株HdMhr581 突变株HdTr142/HdTr51 (抗2-甲基组氨酸) (抗1,2,4-三唑-3-丙氨酸) 噬菌体PS20 组氨酸产生菌HT2892,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌,8.2.3 利用原生质体转化法选育氨基酸产生菌 转化法-受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段，并将它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。 氨基酸产生菌一般为非感受态细胞，需先制成原生体，再转化。,第八章 氨基酸
10、产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.1 概述,重组DNA技术（基因工程） 操作步骤： 工具酶和载体的选择 目的基因的制备 化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR DNA体外重组和外源基因的扩增与表达 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.1 概述,(1) 工具酶 限制性内切酶 EcoR I GAATTC CTTAAG 目前已发现200多种 其它工具酶：DNA聚合酶、DNA连接酶、末端转移酶、T4连接酶、反转录酶等,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3
11、用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.1 概述,(2) 寄主载体系统 脱离染色体的基因不能复制，需要无性繁殖系。 (3) 目的基因的制备与克隆 (4) 转化系统 (5) 目的基因的表达,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.2 赖氨酸产生菌的构建 赖氨酸产生菌AJ11779 增殖 提取染色体DNA 质粒pUB110 EcoR I EcoR I 连接 枯草杆菌AJ1315 重组质粒 扩增 感受态细胞 DNA 转化子AJ11780 鉴定,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.3 苏氨酸产生菌的构
12、建,8.3.4 其它氨基酸产生菌的构建,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.4 氨基酸工程菌的稳定化,8.4.1 防止回复突变的产生与增殖 (1) 定向选育增加遗传标记的产生菌株 (2) 选育遗传性稳定的菌株 在容易出现回复突变株的培养基中反馈传代，单细胞分离，选择不易出现回复突变株的菌株。 用理化诱变因子反复诱变 (3) 改良培养基的组成 种子培养基和保存培养基营养丰富。 (4) 添加药剂，抑制回复突变株的产生与增殖 (5) 生产管理 定期纯化，并作遗传标记检查。菌种保藏。尽量减少传代次数,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.4 氨基酸工程菌的稳定化,8.4.2 使用改善了世代时
13、间的产生菌株,8.4.3 防止噬菌体的污染,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.5 发酵条件对氨基酸发酵的影响,8.5.1 供养条件对谷氨酸族氨基酸生产的影响 由谷氨酸生物合成谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸等谷氨酸族氨基酸，其生物合成与三羧酸循环关系密切，产物积累受供氧条件的影响极大。 供氧充足，产酸量大；反之，产量低。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.5 发酵条件对氨基酸发酵的影响,8.5.2 供养条件对天冬氨酸族氨基酸生产的影响 天冬氨酸族氨基酸：赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸等 供氧充足，酸产量高；反之，发酵生产受到轻微抑制。,亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵，供氧较低，酸产量
14、高。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.5 发酵条件对氨基酸发酵的影响,8.5.3 氨基酸发酵中NAD(P)H2与ATP产生数的计算 氨基酸发酵中对氧需求的原因： (1) 菌体生长与氨基酸生物合成所必需的ATP是通过好气性能量代谢获得的。 (2)氨基酸生物合成过程中产生的NAD(P)H2需要通过氧再生成 NAD(P)。 研究氨基酸发酵的通气搅拌效果，可以以各种氨基酸生物合成所必需的ATP物质的量（mol）与产生NAD(P)H2的物质的量（mol）为基准。 亮氨酸发酵： 葡萄糖 2/3mol Leu + 2 NAD(P)H2 + 2ATP 谷氨酸发酵（乙醛酸循环） 葡萄糖 2/3mol
15、Glu + 5 1/3 NAD(P)H2 + 2ATP 谷氨酸发酵（磷酸烯醇式丙酮酸羧基化途径） 葡萄糖 Glu + 3 NAD(P)H2 + ATP,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.1 发酵液的预处理和液固分离 分离菌体、细胞碎片、未用完的培养基、核酸和蛋白质等杂质 部分可溶性杂质，改变滤液性质 (1) 高价无机离子 Ca2+ ：草酸钠或草酸 Mg2+ ：磷酸盐 Fe3+ ：黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀 (2) 杂蛋白 等电点沉淀；变性沉淀,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.1 发酵液的预处理和液固分离 (3) 絮
16、凝和絮凝技术 絮凝作用在某些电解质作用下，使扩散双电层的排斥电位降低，破坏胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。 絮凝剂包括天然的聚合物和人工合成的聚合物。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.2 离子交换法 (1) 离子交换树脂提取氨基酸的基本原理 氨基酸是两性电解质，在酸性溶液中，氨基酸以阳离子状态存在，因而能被阳离子交换树脂交换吸附；在碱性溶液中，氨基酸以阴离子状态存在，因而能被阴离子交换树脂交换吸附。 (2) 离子交换的亲和力 各种阳离子具有不同的亲和力，它们对于强酸性阳离子交换树脂的亲和力是随着离子价数和原子序数的增加而增加，而随着水和离子
17、半径的增大而减小。阳离子交换树脂对各种离子亲和力的顺序如下： 强酸性树脂 Fe3+ Al3+ Ca2+ Mg2+ K+ NH4+ Na+ H+ 弱酸性树脂 H+ Fe3+ Al3+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ 排在前面的离子能置换后面的离子。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.2 离子交换法 (3) 对于强酸性阳离子交换树脂，所有氨基酸都能吸附，等电点越高，亲和力越大，交换吸附能力越强。 732树脂对氨基酸的亲和力,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.3 沉淀法 (1)等电点沉淀 (2)特殊试剂沉淀 采用有机或
18、无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的一种分离方法。 (3)有机溶剂沉淀 在氨基酸溶液中，加入与水互溶的有机溶剂，能显著减小氨基酸的溶解度而发生沉淀。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.4 吸附法 用适当的吸附剂，在一定pH条件下，使发酵液中的氨基酸被吸附剂吸附，然后再用适当的洗脱剂将吸附剂上解吸下来，达到浓缩和吸附的目的。 常用吸附剂 无机吸附剂：高岭土、氧化铝、酸性白土 有机吸附剂：凝胶型离子交换树脂、活性炭、分子筛、纤维素,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.4 吸附法 活性炭：我国氨基酸工业中应用最广泛 (1
19、) 优点：吸附力强、分离效果好、价格便宜 (2) 缺点：因生产原料和制备方法不同，很难控制其标准；生产上不同来源的活性炭而得到不同结果；色黑质轻，污染环境。 (3) 分类 粉末状活性炭：总表面积、吸附力、吸附量都特别大，活性炭中吸附力最强。颗粒太细，影响过滤速度，需加压或减压操作。 颗粒状活性炭：总表面积较小，吸附力和吸附量较差。 锦纶-活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末活性炭制成颗粒，吸附力较粉末和颗粒状活性炭都小。锦纶是活性炭的脱活性剂。用于分离前2种活性炭吸附太强而不易洗脱的化合物。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.4 吸附法 活性炭：我国氨基酸工业
20、中应用最广泛 (4) 吸附规律：非极性吸附剂，在水溶液中吸附力最强，有机溶剂中吸附力极弱。 对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。 对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。 对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。 碱性氨基酸在中性条件下吸附，酸性条件解吸；酸性氨基酸在中性条件下吸附，碱性条件下解吸。 随温度升高吸附量增加，直至平衡。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.5 溶剂萃取法 用一种溶剂将物质从另一种溶剂中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶或只部分互溶，能形成便于分离的两相。 物理萃取（简单分子萃取）；化学萃取（反应） (1
21、) 分配定律 分配定律： 萃取液和料液 萃余相和萃取相 萃取相溶质溶度 萃余相溶质溶度 K -分配系数，表示溶质在两相中的浓度比。 定温定压的条件下， K为常数，即分配定律。,充分振荡，静置分层,= K,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.5 溶剂萃取法 (1)分配定律 分配定律的应用条件： 必须是稀溶液 溶质对溶剂的互溶没有影响 溶质在两相中必须是同一种分子类型，即不发生缔合或解离。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.5 溶剂萃取法 (1)分配定律 分离因素：萃取剂对溶质A和溶质B分离能力的大小。 CL,A、 CL
22、,B - 萃取相中溶质A和B的浓度 CR,A、 CR,B - 萃余相中溶质A和B的浓度 KA、KB - 溶质A和B的分配系数,分离因素等于两溶质分配系数之比，表示萃取剂对溶质A和B分离能力的大小，分离因素越大，分离效果越好，易达到提纯目的。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.5 溶剂萃取法 (1)分配定律 萃取操作 混合 分离 溶剂回收,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.5 溶剂萃取法 (1)分配定律 萃取方式 单级萃取-一个混合器和一个分离器 多级错流萃取-多级混合器和分离器 多级逆流萃取-萃取液作为前一级的萃取
23、剂,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.5 溶剂萃取法 (2)影响溶剂萃取的主要因素 pH的影响-影响氨基酸的存在状态；影响分配系数 温度-影响萃取速度和分配系数 化学萃取-利用不同试剂或不同类型的萃取剂与氨基酸反应，形成新的萃和物，扩大相近氨基酸的性质差别，达到提纯和彼此分离的目的。 乳化与去乳化-发酵液中残留的蛋白质等杂质具有表面活性，在进行萃取时引起乳化，使有机相和水相难以分离。去乳化措施：过滤和离心分离；加热；稀释法；加电解质等。 萃取剂的选择,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.7 氨基酸的精制 (1) 常见
24、的浓缩方法和原理 常压蒸发浓缩：0.1MPa，随溶质浓度增大，沸点升高。 减压蒸发浓缩：真空浓缩。真空度越高，沸点越低。 薄膜蒸发浓缩：在真空或常压加热条件下，使液体表面形成薄膜而迅速蒸发（数秒-10s）。 原理：增加汽化表面，液体在形成液膜后具有极大的表面积，热传导快而均匀，较好避免溶质的过热现象，有效成分不易破坏，浓缩效率高。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.7 氨基酸的精制 (2) 常用的干燥方法和原理 干燥是氨基酸生产中的最后一道工序，除去产品所含水分或溶剂，利于加工、贮存和使用。 箱式烘房干燥：用蛇形管式排管通蒸汽加热烘房。氨基酸湿品装铝盘或
25、不锈钢盘，放于烘房架上。80 ，10h。 缺点：设备简单、投资低、干燥不均匀时间长、劳动强度大、操作条件差、生产效率低。不适于大规模生产。 减压干燥：在密闭容器中抽去空气后进行干燥，真空干燥。真空度越高，沸点越低。氨基酸湿品装盘放于加热板上。 缺点：劳动强度大、烘烤时间长。不适于大规模生产。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.7 氨基酸的精制 (2) 常用的干燥方法和原理 气流干燥：瞬间干燥，氨基酸湿品在流态化热空气中迅速进行干燥。几秒内即能使物料干燥。 缺点：终产品含水量0.1-1%；不适于特别黏稠的物料或粉状物；对氨基酸晶体的光泽和外形不利。 传送带
26、式干燥：厚度约5mm，0.9s，含水分 0.2%。对保护氨基酸的晶形较有利。 振动床式干燥：振动传输代替传送带，利用热风干燥的连续干燥机。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.7 氨基酸的精制 (3) 脱色和去热原质-生产药用氨基酸 热原：细菌的一种内毒素，是多糖的磷类脂质和蛋白质等的结合体，是一种不挥发性大分子有机物质。强热稳定性。发酵过程产生的代谢物，与菌种和发酵条件有关。 去除办法：活性炭；二乙胺基乙级葡萄糖凝胶；超滤膜。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.6 氨基酸的提取与精制,8.6.7 氨基酸的精制 (4) 结晶和重结晶 结晶：溶液到晶体生成的三个过程：形成过饱和溶液；晶核形成；晶体成长 重结晶：进一步提纯精制氨基酸，获得高纯度的氨基酸。 粗制或不合格产品 溶解 脱色过滤 结晶,论文,1. 谷氨酸发酵的研究进展 2. 谷氨酸产生菌的研究与开发 3. 味精的清洁生产研究 4. 提高谷氨酸产量的策略 5. 谷氨酸钠的提取研究 6. 自拟,