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1、如何分离鉴定氨基酸混合液？,生物化学与分子生物学实验教学中心,氨基酸的薄层层析(Thin layer chromatography of amino acids),实验目的,掌握薄层层析法的一般原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定 被分离的物质（即氨基酸混合液）。,层析基本概念,层析技术是利用化合物中各组分的物理性质（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最终被分离。 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质
2、的分离纯化，也可用于大量物质的分离纯化和制备。,层析基本概念,固定相：固定相是层析的一个基质。包括固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。,层析技术的分类,（1）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析，前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。 （2）按操作形式不同，可分为柱层析、薄层层析和纸层析。 （3）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层析、凝胶层析、离子交换
3、层析和亲和层析等。,今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄 层层析，合到一起叫：吸附薄层层析。,硅胶薄层层析,实验原理,1.薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）,硅胶吸附薄层层析,实验原理,吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 硅胶：表达式为SiO2XH2O。层析用硅胶是一种多孔
4、性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（SiOH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.,实验原理,硅胶吸附薄层层析的特点：, 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。 硅胶的活化温度通常为105110，不能过高。,实验原理,2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。,实验原理,3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率R
5、f值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。,实验材料,吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析样品：氨基酸混合液,器 材,层析板、尺子、铅笔 烧杯、玻棒、量筒 吹风机 毛细管、层析缸 药匙 烘箱,薄层层析装置,操作步骤薄层板的制备,1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁
6、净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化 70烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。,层析板制备,2cm,1cm,1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。 2、取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm。 3、点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm。,Ala Arg Gly Mix,轻触疾起,操作步骤点样,点样操作,操作步骤 展层、显色,Ala Arg Gly Mix,将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。
7、当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85下烘干，即可显出各层斑点。,试样展开过程,结果计算,Rf =,斑点至原点距离,溶剂前缘至原点距离,小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的 值。 根据值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。,Rf值测量,数据处理,注意事项,1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多， 易造成 斑点过大，互相交叉或拖尾。,复习思考题,硅胶的吸附力与含水量的问题 吸附实验中吸附剂的选择根据 氨基酸纸层析，两者有何区别,Thank You,